《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Bioinspired cardiac-targeted metal-organic framework nanozyme for modulating inflammatory responses in heart failure with preserved ejection fraction
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本研究开发了一种新型心靶向纳米酶NanoAM，其通过清除活性氧（ROS）并调控SOCS3-IRS1-AKT2信号轴，有效改善了高脂饮食诱导的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠模型的舒张功能障碍、高血压、心脏纤维化与心肌肥厚，揭示了多功能纳米酶在应对HFpEF复杂病理生理机制中的治疗潜力。
引言：挑战与机遇
射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）已成为心力衰竭的主要亚型，占所有心力衰竭病例的50%以上。患者表现出典型的心衰症状，但左心室射血分数（LVEF）正常（>50%）。与射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）相比，HFpEF的药物疗法仍然非常有限，这与其发病机制的复杂性和高度异质性有关。临床上，HFpEF患者常伴有以内皮功能障碍和全身性炎症为特征的代谢综合征。由此产生的全身性炎症刺激心脏内皮细胞产生活性氧（ROS），对心肌重塑和心脏收缩舒张功能产生不利影响。越来越多的证据表明，ROS的过度产生和氧化应激在HFpEF的发病机制中扮演着关键角色。因此，清除ROS并恢复抗氧化防御可能是逆转心肌结构重塑和改善临床预后的潜在策略。纳米酶是一类具有酶样活性的纳米材料，可以模拟超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶的活性，近年来在心血管疾病氧化应激干预方面得到了系统评估。本研究旨在开发一种经心房钠尿肽（ANP）修饰的心肌靶向纳米酶NanoAM，通过清除ROS并同时调节胰岛素抵抗通路来改善心脏舒张功能障碍，从而治疗小鼠HFpEF。
材料与方法：从合成到模型
研究获得了国家心血管疾病中心华中分中心伦理委员会的批准。纳米酶Mn-ZIF通过配位-自组装-原位金属掺杂策略合成，并进一步用ANP修饰得到NanoAM。通过透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、动态光散射（DLS）、X射线光电子能谱（XPS）等手段对其形貌、结构、尺寸和元素组成进行了表征。通过检测溶解氧生成、超氧化物歧化酶（SOD）样活性和ABTS自由基清除效率评估了其催化活性。利用CCK-8法、流式细胞术、DCFH-DA探针和JC-1染色分别在体外评估了NanoAM的细胞毒性、ROS清除能力和对线粒体膜电位的影响。通过溶血实验、组织学H&E染色及肝肾功能生化指标检测评估了其生物相容性。利用小动物活体成像系统评估了其心脏靶向效率。
动物实验采用六周龄C57BL/6N小鼠，随机分为三组：正常对照组（NC，正常饮食）、心衰组（HF，高脂饮食（60 kcal%脂肪）和饮用水中添加0.5 g/L L-NAME，持续12周）以及干预组（HFi，在高脂饮食和L-NAME基础上，每周两次通过尾静脉注射15 mg/kg的NanoAM）。通过无创尾动脉血压计测量血压，使用超声心动图评估心脏结构和功能参数，通过压力-容积环分析评估心脏收缩舒张功能。通过天狼星红染色评估心肌纤维化，通过DHE染色评估心肌ROS水平。通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）评估全身糖代谢和胰岛素敏感性。通过qPCR和Western blotting分别检测心脏组织中炎症因子（IL-6, TNF-α, IL-1β, CRP）、SOCS3以及胰岛素抵抗相关蛋白（IRS1, p-AKT2）的表达。通过免疫荧光染色观察葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的膜转位情况。对心脏组织进行了批量RNA测序（RNA-seq），并利用Mfuzz包进行基因共表达聚类分析和KEGG通路富集分析，以探究分子机制。
结果：表征、靶向与疗效
合成的Mn-ZIF纳米酶颗粒呈均匀的多边形形态，单分散性好。其水合动力学直径约为80 ± 20 nm，多分散指数低，zeta电位约为-20.11 mV，表明胶体稳定性良好。XPS分析证实了Mn2+和Zn2+在ZIF骨架中的成功配位。催化活性评估显示，Mn-ZIF在200 mM H2O2中10分钟内可产生9 mg/L溶解氧，对超氧阴离子自由基的半抑制浓度（IC50）为0.0009601 μg/mL，并在不同浓度下表现出强ABTS自由基清除活性，表明其具有集成的SOD样、CAT样和自由基清除样活性。通过表面电位变化证实了ANP的成功修饰。
体外实验表明，NanoAM在高达300 μg/mL的浓度下细胞活力仍保持在70%以上，具有良好的生物安全性。流式细胞术和DCFH-DA检测均显示，NanoAM能有效降低H2O2诱导的AC16细胞内的ROS水平。JC-1染色结果表明，NanoAM可以缓解H2O2引起的线粒体膜电位下降。
体内生物相容性评估显示，NanoAM在浓度高达200 μg/mL时溶血率保持在安全范围内。长期给药后，小鼠心、肝、脾、肺、肾组织未见明显病理改变，肝肾功能指标也无显著差异。活体成像结果显示，Cy5.5标记的NanoAM在注射后6小时能在心脏特异性积累，而非靶向对照组则无此现象，证实了其优异的心脏靶向能力。
在HFpEF小鼠模型中，NanoAM展现出显著的治疗效果。与HF组相比，NanoAM干预显著降低了小鼠的收缩压和舒张压。超声心动图检查显示，三组间左心室射血分数（EF）和短轴缩短率（FS）无显著差异，符合HFpEF特征。然而，HF组小鼠的E/A比值降低，等容舒张时间（IVRT）和E/E‘比值升高，提示存在舒张功能障碍。NanoAM治疗后，这些参数均得到显著改善，E/A比值恢复，IVRT和E/E’比值降低。压力-容积环分析表明，HF组小鼠舒张期压力-容积关系（EDPVR）斜率β显著增加，而NanoAM治疗后该值恢复正常，进一步证实了其对舒张功能的改善作用。HF组小鼠血清NT-proBNP水平升高，NanoAM干预后其水平显著下降。天狼星红染色显示，HF组小鼠心肌胶原沉积显著增加，而NanoAM治疗有效减少了纤维化面积。DHE染色显示，HF组心肌ROS水平显著升高，NanoAM治疗后ROS水平大幅降低。此外，NanoAM还降低了HFpEF小鼠的心重/胫骨长度比（HW/TL）。
机制探索：从转录组到信号轴
为了探究NanoAM的作用机制，研究人员对三组小鼠的心脏组织进行了批量RNA测序。主成分分析（PCA）和样本相关性分析显示了良好的组内一致性。通过Mfuzz聚类分析，研究人员识别出六个具有共表达模式的基因簇。KEGG通路富集分析显示，这些基因簇显著富集于代谢相关通路，其中胰岛素抵抗通路富集最为显著。进一步整合差异表达基因分析发现，细胞因子信号抑制因子3（SOCS3）是关键的重叠基因，其在HF组心脏中表达上调，而在NanoAM干预后表达下调。
SOCS3是细胞因子信号的关键抑制因子，可由IL-6等炎症因子诱导产生，并通过靶向IRS1抑制胰岛素信号。Western blot分析证实，NanoAM下调了心脏组织中SOCS3的蛋白表达，减少了IRS1在Ser307位点的磷酸化（这通常与胰岛素抵抗相关），增强了AKT2的磷酸化。qPCR结果进一步显示，NanoAM显著降低了HFpEF心脏中SOCS3以及IL-6、TNF-α、IL-1β和CRP等炎症因子的mRNA表达水平。血清检测也表明，NanoAM降低了HFpEF小鼠升高的IL-6和高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平。免疫荧光染色显示，NanoAM促进了GLUT4从细胞质向细胞膜的转位，这表明心肌细胞的葡萄糖摄取能力得到改善。
讨论：双管齐下的治疗策略
HFpEF的治疗是心血管疾病领域的主要挑战。本研究表明，氧化应激和胰岛素抵抗在其病理过程中至关重要。受天然锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）催化机制的启发，合理设计的Mn-ZIF纳米酶通过模拟其活性中心，展现出高效的SOD样活性。通过ANP抗体修饰实现的心脏靶向策略，使NanoAM能够特异性地在心脏积累，最大限度地减少了脱靶效应，并显示出良好的生物相容性和安全性。
研究证实，NanoAM不仅能有效清除心肌ROS，还能改善HFpEF相关的全身性炎症和胰岛素抵抗。转录组学分析揭示了胰岛素抵抗通路的关键作用，而SOCS3被确定为该通路中受NanoAM调控的核心节点。SOCS3的过表达会与IRS1结合并促进其泛素化和降解，导致胰岛素敏感性降低。NanoAM通过下调SOCS3，解除了其对IRS1的抑制，进而激活了下游的PI3K/AKT信号通路。活化的AKT促进其底物AS160磷酸化，解除对GLUT4的抑制，从而促使GLUT4转位至细胞膜，增强葡萄糖摄取。因此，NanoAM的治疗效果可能通过双重机制实现：一是其固有的ROS清除能力直接减轻氧化损伤；二是通过调控SOCS3-IRS1-AKT2信号轴来改善心脏胰岛素抵抗和能量代谢。
结论与展望
本研究成功开发了一种具有显著心脏靶向能力的ANP修饰纳米酶NanoAM。该纳米酶在体外和体内均表现出优异的靶向性、生物相容性和安全性。在高脂饮食诱导的HFpEF小鼠模型中，NanoAM能显著改善心脏舒张功能障碍、降低血压、减轻心脏纤维化和心肌肥厚。机制研究表明，其疗效不仅源于直接的ROS清除作用，还涉及通过调节SOCS3-IRS1-AKT2信号轴来改善胰岛素抵抗。这些发现为HFpEF的临床治疗提供了新的见解和潜在的干预靶点。未来的研究将利用高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术更精确地评估心脏局部胰岛素抵抗，并深入探究SOCS3与IRS1相互作用导致后者泛素化降解的具体分子机制，以进一步增强该纳米酶的生物活性。
