《Frontiers in Microbiology》：Establishment of a stable monoculture system for Entodinium furca monolobum and isolation of Escherichia spp. as growth-promoting bacteria
引言
瘤胃是一个复杂的厌氧微生物生态系统，其中细菌、古菌、原生动物、真菌等多种微生物共同参与饲料碳水化合物的发酵，为宿主提供养分。瘤胃纤毛虫是瘤胃内最主要的原生动物，在反刍动物瘤胃液中密度可达108–109个/升，占总微生物生物量的比例高达50%。它们在饲料消化发酵、甲烷生成、氮利用效率调节以及通过与其他微生物的复杂相互作用维持瘤胃微生物群落稳定性方面扮演着至关重要的角色。
在瘤胃纤毛虫丰富的群落中，内毛属（Entodinium）通常是优势属，其具体丰度因宿主物种和日粮而异。内毛属物种表现出显著的环境适应性，能够有效摄取淀粉颗粒并选择性吞噬细菌，其每日摄入的细菌量可达瘤胃细菌总量的24%。通过水解细菌蛋白质为氨基酸，这些纤毛虫不仅能满足自身的营养需求，还能同时促进纤维素降解和挥发性脂肪酸的产生，从而对维持瘤胃生态系统稳态做出重要贡献。
为了深入阐明瘤胃纤毛虫的详细生理和代谢机制，建立稳定的体外培养体系至关重要。然而，尽管针对其他一些代表性纤毛虫（如Entodinium caudatum）的培养体系已有报道，但针对Entodinium furca monolobum，先前的研究缺乏其建立和维持单一培养的详细方法学信息。早期研究利用无菌培养的Entodinium caudatum提供了初步证据，表明活细菌的存在对纤毛虫的存活和生长至关重要。抗生素处理实验进一步证实了这种细菌依赖性，消除相关细菌群落会导致纤毛虫生存能力受损，而补充细菌后其生长可恢复正常。这些观察结果表明，瘤胃纤毛虫在营养和代谢上对其细菌伙伴存在根本性依赖。
本研究旨在建立一个详细的方案，以推进Entodinium furca monolobum的单一培养，并系统分析其相关的细菌群落。我们从单一培养上清液和纤毛虫相关群落组分中分离并鉴定了细菌物种，通过共培养实验评估了它们对纤毛虫增殖的影响。这项工作不仅克服了长期维持Entodinium furca monolobum体外培养的挑战，也为开发明确的单菌共生系统提供了方法学框架，将有助于未来在瘤胃生态系统内开展对原生动物-细菌相互作用的机理研究。
材料与方法
本研究中的所有动物实验程序均遵循相关管理条例进行，并获得了机构动物护理与使用委员会的批准。
Entodinium furca monolobum的体外单一培养
分离与富集：从中国湖北省武汉某牧场的荷斯坦奶牛采集新鲜瘤胃内容物。将瘤胃内容物通过四层无菌纱布过滤，并在39°C厌氧条件下立即运送至实验室。滤液转移至预热的分液漏斗中，在39°C孵育60分钟以富集纤毛虫。随后，将悬浮液依次通过50微米和20微米尼龙网筛，以富集小型纤毛虫。小于20微米的组分接种到SP盐溶液中。形态学观察表明，初始接种物中约30%为Entodinium furca monolobum。
纯化与单一培养：使用改良的SP培养基（底物悬浮液包含2%全麦粉和2%大米淀粉）培养Entodinium furca monolobum。该过程包括两个主要步骤：纯化及随后的单一培养建立。纯化分两个阶段进行。首先，混合培养物在常规饲喂和传代条件下维持一个月。然后将培养物通过10微米网筛以富集内毛属物种，得到Entodinium furca monolobum占比约80%的制备物。从这个富集组分开始，通过每三天将2毫升培养物转移到8毫升新鲜培养基中，维持连续稀释培养一个月。通过形态学检查和18S rRNA基因测序验证了培养纤毛虫的纯度。为建立单一培养，将5毫升纯化悬浮液接种到5毫升改良SP培养基中，并在相同条件下培养。如先前描述的方法，通过显微镜进行纤毛虫计数。
Entodinium furca monolobum的鉴定：基于关键形态特征（如体长、形状、细胞核、尾棘结构和纤毛区），使用微分干涉相差显微镜对培养物进行形态学鉴定。为了进行分子确认，从三个重复样本（各含50个纤毛虫）中提取基因组DNA，使用纤毛虫特异性引物扩增18S rRNA基因。PCR产物经测序后，与GenBank序列进行比对以确定物种。使用PhyloSuite软件进行系统发育分析，利用27条瘤胃纤毛虫18S rRNA序列和三个外群构建系统发育树。
促生长细菌的分离与鉴定
细菌培养基与培养条件：鉴于羧甲基纤维素钠（CMC-Na）琼脂培养基可有效分离功能性瘤胃细菌，而营养琼脂培养基是常见的细菌培养基，因此从单一培养上清液和纤毛虫相关群落中分离的菌株均在这两种培养基上维持。由于长期实验室单一培养条件下的细菌群落包含耐受微氧条件的类群，分离工作在有氧和厌氧条件下于39°C进行。纯化的细菌分离株保存在LB肉汤中，并于39°C、180 rpm摇床培养8小时。
从单一培养上清液中分离和纯化细菌：在有氧和厌氧条件下，将100微升单一培养上清液用无菌生理盐水从10?1连续稀释到10?3。从每个稀释度取100微升涂布在营养琼脂和CMC-Na琼脂平板上，在相应条件下于39°C培养12-24小时。同时，以等体积无菌生理盐水涂布平板作为对照。挑选形态不同的单菌落，采用划线法传代培养直至获得纯培养物。纯化的菌落接种到LB肉汤中，在39°C、180 rpm条件下摇床培养8小时。革兰氏染色用于初步表征。
纤毛虫相关细菌的分离与纯化：按照Gutierrez描述的方法获取纤毛虫相关细菌。简要来说，收集50个纤毛虫，在预先装有无菌SP盐溶液的8孔玻璃凹玻片上用无菌微量移液器洗涤，然后转移到无菌载玻片上，用另一张载玻片压碎裂解。向压碎的纤毛虫中加入数滴无菌生理盐水制成悬浮液。将该悬浮液稀释后，在上述有氧/厌氧条件下铺板。作为阴性对照，等体积无菌生理盐水涂布于对照平板。菌落纯化、革兰氏染色，并于39°C LB肉汤中保存。
分离菌株的分子鉴定与系统发育分析：使用试剂盒提取DNA。用通用引物27F/1492R扩增16S rRNA基因。扩增子经测序后，与NCBI数据库进行比对以确定分类学归属，并遵循与上述相同的流程进行系统发育分析。
促生长细菌的筛选
评估细菌对Entodinium furca monolobum的促生长效应：选择在单一培养上清液和纤毛虫相关群落中均存在的细菌菌株（代表潜在的共生细菌，推测具有促生长作用）与Entodinium furca monolobum进行共培养。每天向Entodinium furca monolobum单一培养物中添加0.3%体积的细菌悬浮液（107CFU/mL）以建立共培养系统，评估其促生长效应。对照组每天补充等体积的改良SP培养基。
为了进行比较，新鲜瘤胃液首先在3,000 × g离心3分钟去除纤毛虫，上清液再在10,000 × g离心10分钟制备RF组。共培养后，收集未添加细菌的单一培养物中的纤毛虫，在无菌SP盐溶液中通过500 × g离心3分钟洗涤五次，所得沉淀标记为Cm组。为了获取对照上清液细菌，将上清液通过2.6微米尼龙网过滤去除纤毛虫，然后在10,000 × g离心10分钟收集细菌，标记为Cs组。补充大肠杆菌（Escherichia coli）或费氏大肠杆菌（E. fergusonii）的共培养物以类似方式处理，分别标记为Em/Es和Fm/Fs组。所有样品在DNA提取和扩增子测序前储存于-80°C。在共培养实验期间，通过每日细胞计数监测Entodinium furca monolobum的生长情况，并根据这些数据绘制生长曲线。
利用扩增子测序进行微生物群分析：使用CTAB法提取总基因组DNA。用引物515F/806R扩增16S rRNA基因的V4区。PCR产物纯化后用于构建文库，并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。原始序列使用DADA2流程进行质量过滤、去噪和配对末端读取合并，以生成扩增子序列变体。使用QIIME 2的q2-feature-classifier插件，以SILVA v138.1数据库为参考，对ASVs进行物种分类注释。基于分类注释结果，我们在定义的分类学级别上生成分类学丰度谱。
统计分析
所有实验均进行三次重复。生长数据使用双向重复测量方差分析结合Greenhouse–Geisser校正和Tukey检验进行分析。统计显著性设定为p < 0.05。使用Origin 2024软件进行数据可视化。
结果
Entodinium furca monolobum的体外单一培养
基于我们先前培养Entodinium caudatum WH株和Dasytricha ruminantium的经验，我们采用了两步策略，即混合培养和连续稀释培养，来纯化Entodinium furca monolobum。首先将富集的接种物在混合培养中维持一个月，得到Entodinium furca monolobum占比约80%的种群。随后，进行一个月的连续稀释纯化，最终获得100%由Entodinium furca monolobum组成的培养物。
形态学观察证实该培养物完全由Entodinium furca monolobum组成。细胞呈细小、拉长的椭圆形，长度25–40微米，宽度20–30微米，未观察到骨架板。前端平截，无尾棘。纤毛区位于前庭附近。纤毛在摄食和运动时向外伸出，但在暴露于不利环境条件时缩回细胞内。细胞质内观察到多个食物泡。这些形态特征与Dehority的描述一致，表明该单一培养物为Entodinium furca monolobum。此外，在单一培养中观察到了活跃的分裂细胞。在分裂过程中，新的纤毛器原基在细胞中部形成，最终分离产生两个独立的细胞，原基发育为子细胞的口部纤毛区。这些结果表明，Entodinium furca monolobum可以在改良的SP培养基中稳定维持并有效增殖。
该单一培养物的18S rRNA基因成功被扩增和测序。BLAST分析表明，获得的序列与GenBank中Entodinium furca monolobum的18S rRNA基因序列同源性最高，序列一致性达99.80%。贝叶斯推理和最大似然法构建的系统发育树拓扑结构一致，该单一培养纤毛虫的18S rRNA序列与GenBank中报道的Entodinium furca monolobum序列形成一个具有高支持度的姐妹群。因此，鉴定该单一培养的纤毛虫为Entodinium furca monolobum。
Entodinium furca monolobum单一培养相关细菌的分离与鉴定
从单一培养上清液和纤毛虫相关群落中分离和纯化细菌：从单一培养上清液中，在不同的培养条件下获得了23株细菌。在有氧条件下，在营养琼脂培养基上获得了6个形态不同的菌落，在CMC-Na琼脂培养基上获得了7个菌落。厌氧培养在营养琼脂培养基上产生了10个不同的菌落。从纤毛虫相关群落中，分离出11个不同的菌株。有氧培养在营养琼脂培养基上产生4个菌落，在CMC-Na琼脂培养基上产生2个菌落。厌氧培养在营养琼脂培养基上产生3个菌落，在CMC-Na琼脂培养基上产生2个菌落。相比之下，所有对照平板上均未观察到菌落。
分离菌株的鉴定：从34个细菌分离株（包括来自单一培养上清液的23个菌株和来自纤毛虫相关群落的11个菌株）中提取基因组DNA。16S rRNA基因的PCR扩增产生了约1,400 bp的产物。将获得的16S rRNA基因序列与NCBI数据库进行BLAST分析以验证物种水平归属，并进一步通过系统发育树评估分类学地位。来自单一培养上清液的23个分离株被鉴定为8个物种：大肠杆菌（Escherichia coli）、费氏大肠杆菌（E. fergusonii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、巨大普里斯蒂亚菌（Priestia megaterium）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、特基拉芽孢杆菌（B. tequilensis）和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）。来自纤毛虫相关群落的11个分离株被归类为4个物种：大肠杆菌、费氏大肠杆菌、福氏志贺菌（Shigella flexneri）和变异不动杆菌（Acinetobacter variabilis）。
促生长细菌的筛选
细菌菌株对Entodinium furca monolobum增殖的影响：比较来自单一培养上清液和纤毛虫相关群落的细菌分离株，我们发现大肠杆菌和费氏大肠杆菌是两种来源共有的物种。为了评估它们的促生长潜力，分别用每种细菌悬浮液（107CFU/mL，30微升）补充Entodinium furca monolobum的单一培养物。补充等体积改良SP培养基的单一培养物作为对照。在10天的培养期间，细菌补充增加了Entodinium furca monolobum的增殖。统计分析显示处理和时间的交互作用显著，表明组间的生长轨迹存在显著差异。具体而言，在第10天，Tukey事后检验确认了各处理间细胞密度的显著差异。大肠杆菌处理组达到最高密度，显著高于对照组和费氏大肠杆菌处理组。费氏大肠杆菌处理组的细胞密度也显著高于对照组。
细菌群落多样性和结构
通过高通量16S rRNA基因扩增子测序，对无原生动物瘤胃液和单一培养上清液之间的细菌群落组成进行了比较分析。在门水平上，无原生动物瘤胃液的微生物群主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成。然而，单一培养上清液的细菌群落主要由拟杆菌门主导，其次是变形菌门。
对六个实验组（Em, Es, Fm, Fs, Cm, Cs）的18个样本进行扩增子测序，共获得1,936,797条原始序列。经过质量过滤和嵌合体去除，保留了1,849,066条有效序列。使用DADA2在100%同一性聚类下去噪产生了898个ASV。Cs组表现出最高的ASV丰富度，而Em组最低。
在纲水平上展示了每个处理组的细菌群落组成。Em和Es组显示出相似的组成，分别包含21和20个细菌纲。在这两组中，γ-变形菌纲是最丰富的纲，其次是拟杆菌纲和Negativicutes纲。Fm和Fs组包含21和20个纲，拟杆菌纲占最大比例，其次是γ-变形菌纲和螺旋体纲。Cm和Cs组均包含20个纲，拟杆菌纲仍是最优势的类群，其次是γ-变形菌纲和螺旋体纲。
讨论
内毛属是瘤胃纤毛虫中最普遍的属，由于其高丰度而表现出最强的细菌摄取能力。本研究成功建立了Entodinium furca monolobum的单一培养，为探索瘤胃微生物生理学和纤毛虫-细菌相互作用提供了一个强大的模型。参考本实验室开发的Entodinium caudatum单一培养方法，我们通过重复过滤优化了纯化过程，并通过用全麦粉和大米淀粉替换小麦粉和苜蓿粉改良了培养底物。后者提供了更丰富的营养，从而支持了纤毛虫的稳定生长。值得注意的是，单一培养上清液中的细菌群落与无原生动物瘤胃液中的细菌群落存在显著差异。虽然体外系统旨在模拟瘤胃环境，但其复杂性远低于天然生态系统，这有利于能够快速适应的细菌类群的增殖。
瘤胃纤毛虫在细菌依赖性和摄食偏好方面表现出相当大的种间差异。尽管细菌蛋白通常促进纤毛虫增殖，但不同纤毛虫物种表现出不同的营养策略。例如，较小的内毛属物种如Entodinium caudatum和Entodinium simplex严重依赖细菌供应氮和能量，从而增加了细菌消耗率。相比之下，Epidinium caudatum消耗的细菌较少，但能更有效地利用游离氨基酸。其他属如Eudiplodinium和Isotricha可以利用细菌和环境氨基酸，而Polyplastron multivesiculatum主要依赖游离氨基酸满足其氮需求。先前的研究报道了变形菌门与某些瘤胃纤毛虫的普遍关联。我们发现来自该门的细菌（特别是埃希氏菌属）能促进纤毛虫生长，这增加了此类关联可能具有功能重要性、有助于纤毛虫种群稳定性并进而维持瘤胃微生物生态系统的可能性。
纤毛虫相关细菌在维持纤毛虫生长方面起着关键作用，既是必需的营养提供者，也是生态调节者。先前结合电子显微镜和生物信息学的研究揭示了培养上清液和纤毛虫相关细菌的多样性。现在普遍认为，细菌补充极大地促进了多种纤毛虫物种体外培养的建立。除了作为猎物，细菌还提供氨基酸、核酸、维生素，甚至为纤毛虫生存创造有利的厌氧条件。基于这些见解，我们调查了从单一培养上清液和纤毛虫相关群落中分离的菌株是否能促进Entodinium furca monolobum的生长。两种来源共有的分离株可能表明它们与纤毛虫建立了密切且功能上合作的关系。我们的研究结果显示，大肠杆菌和费氏大肠杆菌均能显著促进纤毛虫增殖，其中大肠杆菌的作用更强。大肠杆菌的优越促生长效应可能归因于其增强的产生和分泌刺激生长代谢物的能力，这些代谢物正向调节纤毛虫的代谢途径。
据我们所知，这是首次报道鉴定出能促进Entodinium furca monolobum体外生长的细菌菌株。这里建立的培养方法为优化其他厌氧瘤胃纤毛虫的培养提供了有价值的参考。然而，需要承认的是，基于培养的分离是有选择性的。这里使用的培养基和培养条件不太可能恢复许多挑剔和严格厌氧的细菌类群。因此，获得的分离株仅代表群落中易于培养的部分，不应解释为代表原位瘤胃微生物群。考虑到这一限制，我们的策略有意优先选择了那些能在长期实验室培养条件下持续存在并与纤毛虫保持相互作用的分离株。我们获得的埃希氏菌属分离株增强了纤毛虫的生长，表明它们具有功能相关性。此外，这种共培养系统为剖析纤毛虫-细菌共生关系提供了一个易于操作的实验模型，包括细菌逃避消化和分泌生长因子等机制。在未来的研究中，使用添加单一细菌伙伴的确定培养基开发Entodinium furca monolobum的单菌共生培养系统，将允许精确分析它们的相互作用。最终，这些有针对性的共培养策略为建立高效稳定的瘤胃纤毛虫体外培养系统提供了理论基础，并提供了通过关键微生物伙伴操纵瘤胃微生物生态系统的新机会。
结论
本研究报告了使用改良SP培养基成功建立了Entodinium furca monolobum的稳定单一培养，从而克服了其长期依赖混合纤毛虫培养以及缺乏确定培养方案的局限性。通过对单一培养上清液和纤毛虫相关群落中细菌的分离和鉴定，确定了大肠杆菌和费氏大肠杆菌为关键的促生长物种。共培养实验证实了它们促进纤毛虫增殖的能力，微生物群落分析进一步揭示了补充大肠杆菌的培养物中γ-变形菌纲占主导地位的转变。这些发现为建立Entodinium furca monolobum的单菌共生培养提供了方法学突破，为研究原生动物生理学提供了一个有价值的模型，并为开发其他厌氧纤毛虫的体外培养策略奠定了基础。
