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本文通过机器学习驱动的数字组织病理学技术，对Wesselsbron病毒（WSLV）感染绵羊肝脏后的免疫细胞浸润、病毒抗原（NS1）分布及肝细胞增殖指数（Ki67 PI）等进行了定量分析。研究发现WSLV感染导致显著的淋巴细胞、组织细胞（Iba1+）浸润和肝细胞增殖，且这些数字病理参数与病毒载量（RT-qPCR）及肝损伤标志物（AST、ADA等）呈正相关。该研究展示了数字病理在客观、定量表征病毒性肝炎病理改变方面的价值，并揭示了不同病毒株（rSA999 vs. SAH177）致病性的潜在差异。
引言
Wesselsbron病毒（WSLV）是一种人畜共患、被忽视的蚊媒正黄病毒，主要感染撒哈拉以南非洲的家养及野生反刍动物，亦可感染人类。其感染在成年绵羊中常呈亚临床经过，但在新生羔羊中可导致严重疾病和高死亡率。肝脏和肝细胞是WSLV的主要靶器官和靶细胞，因此肝病理学是疾病表征的关键。传统组织病理学评估存在主观性和半定量局限。本研究采用基于全玻片成像（WSI）和深度学习（DL）的数字病理学方法，对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的绵羊肝脏样本进行定量分析，旨在客观表征WSLV诱导的肝炎关键改变。
材料与方法
本研究使用了先前实验感染的20份肝脏样本（包括13只母羊和7只羔羊），动物分别感染了WSLV clade I（rSA999）或 clade II（SAH117）毒株，并设有模拟接种对照组。对连续切片进行了针对T细胞（CD3）、B细胞（PAX5）、组织细胞/巨噬细胞（Iba1）、WSLV非结构蛋白1（NS1）的免疫组织化学（IHC）单染，以及精氨酸酶1（Arg1）和Ki67的双染以评估肝细胞增殖指数（PI）。所有玻片经数字化扫描后，使用Visiopharm软件进行机器学习驱动的定量分析，具体包括组织检测、各类阳性细胞或区域的识别与计数。所得数字参数与此前已获得的肝脏WSLV病毒RNA载量（RT-qPCR）及血清肝损伤标志物（天冬氨酸转氨酶[AST]、胆红素、腺苷脱氨酶[ADA]）数据进行相关性分析。
结果
肝脏病理学：组织学观察显示，WSLV感染动物出现多灶性随机坏死性肝炎，伴有以淋巴细胞和组织细胞为主的浸润，而对照组未见此类病变。
CD3+T细胞：CD3+T细胞密度在WSLV感染动物中显著高于对照组，并且在感染rSA999毒株的动物（尤其是母羊）中高于感染SAH177毒株的动物。
PAX5+B细胞：PAX5+B细胞密度约为T细胞的十分之一，主要位于汇管区。rSA999感染组的B细胞密度显著高于SAH177组和对照组。此外，无论感染状态如何，母羊的B细胞密度均高于羔羊。
Iba1+组织细胞：Iba1染色阳性（包括库普弗细胞和单核细胞来源的巨噬细胞）面积在WSLV感染动物中显著增加，且在rSA999组中比SAH177组更为明显，尽管两组间差异未达统计学显著性。
肝细胞Ki67增殖指数：通过Arg1与Ki67双染计算肝细胞特异性PI。WSLV感染动物的肝细胞PI显著高于对照组，表明感染后肝细胞再生增强。这种增加在rSA999组比SAH177组更为显著。
WSLV NS1 IHC：WSLV NS1染色呈粗颗粒状，主要位于肝细胞和库普弗细胞胞质内。数字化定量显示，rSA999组的NS1阳性面积有高于SAH177组的趋势。对照组均为阴性或接近零值。
相关性分析：数字病理学参数与病毒载量及肝损伤标志物之间存在显著正相关。其中，Iba1阳性面积与肝脏WSLV RNA载量的相关性最强（Spearman's ρ = 0.84），其次是WSLV NS1 IHC、Ki67 PI和CD3+细胞密度。AST水平与WSLV NS1和PAX5密度正相关，胆红素与Ki67 PI正相关，ADA与PAX5染色正相关。
讨论
本研究通过深度学习驱动的数字病理学分析，系统定量了WSLV诱导的轻度至中度肝炎中的免疫细胞浸润和肝细胞增殖。研究发现，组织细胞（Iba1+）的浸润与病毒载量相关性最强，凸显了其在WSLV肝炎中的核心作用。T淋巴细胞（CD3+）的显著增加表明细胞免疫应答的重要性，可能参与病毒清除和/或肝细胞损伤。B淋巴细胞（PAX5+）浸润程度较低，提示其在WSLV肝炎中作用有限，但在rSA999感染组中有所增加。肝细胞增殖指数（Ki67 PI）的升高证实了感染后存在肝再生反应。数字病理分析成功区分了感染与未感染动物，并揭示了rSA999毒株相比SAH177毒株可能引起更强烈的淋巴细胞浸润，这与之前生化指标提示rSA999致病性更强的结论一致。WSLV NS1 IHC定量与RT-qPCR结果的正相关表明，IHC NS1定量可作为评估肝脏病毒负荷的补充手段。
结论
本研究首次对WSLV诱导的肝炎进行了全面、定量、自动化的数字组织病理学分析，证明了机器学习驱动的全玻片图像分析技术在客观、精细表征病毒感染性肝炎病理改变方面的强大能力。即使面对轻微的组织学病变，该技术也能有效区分感染状态和不同毒株的致病性差异。该研究为理解WSLV的免疫发病机制提供了新见解，并展示了数字病理学在传染病研究中的广泛应用前景。未来通过增加免疫细胞亚型标记物和分析多个感染时间点样本，可进一步深化对该疾病病理过程的认识。
