《Journal of Materials Chemistry B》：Co-delivery of synaptogenic and angiogenic nanoparticles in MAP scaffolds enhances post-stroke synapse formation
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本研究创新性地将促突触形成蛋白血小板反应蛋白1（TSP-1）与促血管生成纳米颗粒（CLUVENA）共同装载于微孔退火颗粒（MAP）支架中，并用于小鼠缺血性脑卒中模型。结果显示，该协同递送策略能在梗塞灶及周围显著促进突触形成，并维持血管生成，同时调节胶质瘢痕与轴突发芽。尽管轴突延伸受限，但TSP-1纳米颗粒治疗最终提升了动物的运动功能恢复。这一工作为通过生物材料时空控释突触形成信号以引导卒中后神经环路修复提供了新范式。
引言
缺血性脑卒中是导致长期残疾的主要原因之一，其根本问题在于梗塞灶内神经连接的破坏。尽管卒中后存在有限的自发性神经重塑，但超过三分之二患者仍遗留终生残疾。微孔退火颗粒（MAP）支架是一种由共价交联微凝胶构成的三维支架，能促进细胞浸润并防止梗塞区纤维化收缩。此前研究显示，仅在MAP中共同递送促血管生成的簇状VEGF肝素纳米颗粒（CLUVENA）才能在中风模型中观察到行为改善，但功能恢复延迟至12周，可能源于缺乏主动引导突触形成与记忆印迹精细化的机制。
血小板反应蛋白1（TSP-1）是一种由星形胶质细胞分泌的三聚体糖蛋白，可通过与神经元电压门控钙通道α2δ-1亚基相互作用促进兴奋性突触形成。在缺血性卒中背景下，敲除TSP-1与TSP-2会严重损害轴突发芽和突触形成，导致功能恢复更差。本研究旨在探索将促血管生成的CLUVENA与促突触形成的TSP-1共同递送至MAP支架中，以期协同促进卒中后的组织修复与行为恢复。
TSP-1与肝素纳米颗粒的结合及表征
研究首先将TSP-1通过硫醇-烯点击化学共价连接到肝素纳米颗粒上，形成TSP-1纳米颗粒（TSP-1 NP）。动态光散射显示纳米颗粒直径约120 nm，且在水中4小时内聚集程度不显著。TSP-1与肝素纳米颗粒的结合效率达99.8%。表面电荷分析表明，TSP-1功能化使纳米颗粒的ζ电位相对于裸露肝素纳米颗粒有所增加，而CLUVENA纳米颗粒则表现出进一步的变化，这与蛋白质的电荷分布特性一致。
MAP支架中TSP-1的持续释放
通过ELISA检测光血栓性（PT）卒中模型中TSP-1蛋白表达，发现卒中后5天，患侧半球TSP-1蛋白水平呈中度但不显著的下降。研究将TSP-1纳米颗粒与可溶性TSP-1（TSP-1 Sol）以200 ng TSP-1/6 μL MAP的浓度载入MAP支架。体外释放实验显示，可溶性TSP-1在最初24小时爆发释放约70 ng，而TSP-1纳米颗粒则在首日释放约15 ng，随后6天维持每日低于5 ng的持续释放。这表明纳米颗粒制剂能在植入部位维持局部治疗浓度的TSP-1。
TSP-1纳米颗粒在体外和体内均保留促突触形成生物活性
体外突触形成实验显示，用50 ng mL?1的可溶性或纳米颗粒形式TSP-1处理皮层神经元48小时后，两者在vGlut1斑点密度上无统计学差异，且均显著高于未处理组或加巴喷丁（TSP-1竞争性抑制剂）共处理组，证实纳米颗粒结合的TSP-1保留了生物活性。
在体内实验中，MAP支架递送可溶性或纳米颗粒形式的TSP-1均能使梗塞灶及周围区域的突触存在增加2倍以上，表明两种形式的TSP-1递送均能在体内有效诱导突触形成。
TSP-1的引入不影响CLUVENA诱导的血管生成
尽管文献报道TSP-1具有抗血管生成作用，但本研究将载有CLUVENA（含200 ng VEGF）及200 ng TSP-1（可溶性或纳米颗粒形式）的MAP支架于卒中后5天颅内注射至梗塞灶。15天后分析发现，所有含CLUVENA的MAP处理组在梗塞区的血管化均比仅卒中或单独MAP组有所增加，且TSP-1纳米颗粒并未抑制CLUVENA诱导的VEGF介导的血管生成。各组间在梗塞区血管密度、归一化于DAPI的血管面积以及最大分支长度上均无显著差异，表明TSP-1的局部递送并未损害卒中后微环境中的血管再生。
此外，TSP-1递送似乎影响了MAP支架内的细胞动态。TSP-1纳米颗粒处理组小鼠在梗塞区及周围区域的DAPI阳性面积均高于CLUVENA单独组，提示细胞浸润增加或支架降解增强。
TSP-1在MAP支架中的递送导致星形胶质细胞梗塞迁移减少，但不改变巨噬细胞和小胶质细胞浸润
对胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞的染色分析显示，尽管梗塞核心内的总体星形胶质细胞密度无显著差异，但所有TSP-1治疗组的星形胶质细胞向病灶内的迁移均受到明显限制。值得注意的是，接受TSP-1纳米颗粒的小鼠在梗塞周围区域的胶质瘢痕厚度（135.14 μm ± 24.9）和GFAP阳性面积（13.08% ± 2.10）均显著高于CLUVENA单独组等其他治疗组。体外划痕实验进一步证实，TSP-1纳米颗粒处理降低了星形胶质细胞向划痕区域的迁移。
在免疫细胞方面，各组间在梗塞区或周围区域的巨噬细胞或小胶质细胞密度均无显著差异，表明局部TSP-1纳米颗粒递送可能避免了不良的促炎反应。
TSP-1纳米颗粒治疗限制了轴突发芽
许多卒中研究将梗塞灶及周围区域轴突投射的增加与功能改善相关联。先前工作表明，MAP + CLUVENA处理能增加梗塞内神经元标记物NF200的表达。然而，当CLUVENA与TSP-1纳米颗粒或可溶性TSP-1共同递送时，在梗塞区和周围区域均观察到轴突发芽减少。值得注意的是，可溶性TSP-1在周围区域的轴突发芽（7.14% ± 2.39）明显少于TSP-1纳米颗粒（13.70% ± 1.59）和CLUVENA单独组（23.61% ± 4.59）。研究者推测，此前观察到的TSP-1治疗导致的胶质屏障增厚可能限制了NF200阳性轴突向梗塞内的延伸。
TSP-1提升缺血性脑卒中后患侧前肢使用率
功能恢复是缺血性脑卒中治疗的主要目标。通过在左侧运动皮层诱导局灶性缺血，预计会导致对侧运动缺陷。研究者使用圆柱体测试，并通过六台同步相机记录，利用三维对齐神经网络计算行为学（DANNCE）进行高分辨率行为量化。到卒中后第54天，接受TSP-1纳米颗粒治疗的动物在圆柱体测试中使用受影响对侧前爪的频率显著增加，表明运动功能相比可溶性TSP-1治疗组有所改善。
结论
本研究评估了在缺血性脑卒中背景下递送可溶性与纳米颗粒形式TSP-1的可行性及治疗潜力。通过利用TSP-1内源性促突触形成作用，旨在恢复梗塞及周围区域的神经环路。结果显示，该策略在卒中核心周围区域促进了突触形成，并揭示了神经血管、免疫和突触过程在恢复期间相互作用的新见解。
尽管TSP-1已知具有抗血管生成作用，但本研究中使用的局部TSP-1浓度（约200 ng）低于体外通过CD36和CD47信号抑制血管生成所需的阈值（>0.5 μg mL?1），因此并未损害必要的血管再生。
TSP-1治疗还导致梗塞内DAPI阳性区域增加，可能由于TSP-1上调内皮细胞中基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达，从而促进了包含MMP可切割序列的MAP支架降解，为细胞浸润创造了空间。
星形胶质细胞反应是影响恢复的关键因素。TSP-1纳米颗粒处理显著增加了梗塞周围区域的胶质瘢痕厚度和GFAP阳性面积，提示其可能增强了局灶性星形胶质细胞增生。
最重要的发现是，TSP-1递送促进了突触形成，但限制了轴突向梗塞内的延伸。这突显了神经修复中的一个关键挑战：促突触形成信号与促轴突生长信号的时间必须仔细平衡。过早诱导突触形成可能会在实现足够的靶点连接之前就稳定了连接，从而阻碍轴突延伸。
总之，这些结果强调了在卒中后大脑中更精确地时空调控突触形成信号的必要性。未来该平台的迭代可能包括控释策略或环境响应性递送系统，以延迟TSP-1活性的开始时间，直至轴突再生的结构基础奠定。通过这种方式，有望更有效地平衡轴突生长与突触稳定之间的竞争需求，最终引导大脑实现更完全的功能恢复。
