成纤维细胞活化蛋白通过非酶促机制结合PLAUR/ITGB1驱动巨噬细胞促炎极化促进胸主动脉夹层

《Advanced Science》：Fibroblast Activation Protein Promotes Thoracic Aortic Dissection via PLAUR/ITGB1-Mediated Pro-inflammatory Macrophage Polarization

本文系统揭示了成纤维细胞活化蛋白（FAP）在胸主动脉夹层（TAD）中的新作用机制。研究发现，在TAD病变中，成纤维细胞来源的FAP表达显著上调。令人意外的是，抑制FAP的蛋白酶活性并不能缓解疾病。深入机制表明，FAP通过其非酶促功能位点直接与巨噬细胞表面的尿激酶型纤溶酶原激活物受体（PLAUR）结合，进而激活整合素β1（ITGB1）/黏着斑激酶（FAK）信号通路，驱动巨噬细胞向促炎表型极化，最终导致细胞外基质（ECM）降解和TAD进展。这项研究为理解TAD的发病机制提供了新视角，并提示靶向FAP/PLAUR相互作用可能成为TAD的潜在治疗策略。

　　

文章内容归纳总结

1 引言

胸主动脉夹层（TAD）是一种致命性的血管急症，目前临床上缺乏有效的靶向治疗手段，其发病机制亟待阐明。成纤维细胞活化蛋白（FAP）是一种与组织重塑相关的丝氨酸蛋白酶，在多种病理状态下表达上调，但其在TAD中的作用尚不清楚。本研究旨在揭示FAP在TAD进展中的具体作用及其分子机制。

2 材料与方法

研究使用了人TAD组织样本以及β-氨基丙腈（BAPN）诱导的小鼠TAD模型。通过构建全身性和成纤维细胞特异性Fap基因敲除小鼠，评估了FAP的生物学效应。研究综合运用了高通量测序（包括bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq）、表面等离子共振（SPR）、免疫共沉淀（Co-IP）、药理学抑制（使用Ac-Gly-BoroPro）以及功能挽救实验等多种技术手段，以剖析FAP的酶活与非酶活功能及其与PLAUR/ITGB1信号通路的相互作用。

3 结果

3.1 FAP在TAD病变部位显著上调

基因表达数据库（GEO）分析和实验验证均表明，在TAD患者和小鼠模型的主动脉病变组织中，FAP的mRNA和蛋白表达水平均显著上调。免疫荧光染色进一步显示，FAP的高表达区域与巨噬细胞浸润（CD68⁺）和细胞外基质降解（通过Masson三色染色和弹力纤维EVG染色评估）区域高度重合，提示FAP可能参与TAD的病理过程。

3.2 成纤维细胞来源的FAP在TAD早期阶段上调

单细胞RNA-seq数据分析证实，FAP的表达在TAD的成纤维细胞中特异性富集。在人源和小鼠源组织中，FAP与成纤维细胞标志物波形蛋白（VIMENTIN）共定位，而在内皮细胞（CD31⁺）、平滑肌细胞（αSMA⁺）或巨噬细胞（CD68⁺）中未观察到强共定位。在BAPN诱导的小鼠TAD模型中，时序性实验显示，FAP信号在疾病早期（给药后第1天）即在升主动脉和主动脉弓出现，并随时间推移在所有节段逐渐增强，其上调早于明显的巨噬细胞浸润和ECM降解。

3.3 Fap基因缺失减轻BAPN诱导的TAD早期炎症浸润和ECM降解

与野生型（WT）小鼠相比，全身性Fap敲除（Fap^?/?）小鼠和成纤维细胞特异性敲除（Fap^Postn）小鼠在BAPN诱导后，主动脉的炎症细胞（F4/80⁺）浸润、胶原沉积和弹力纤维断裂均显著减少。同时，促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）的水平也明显降低。延长观察至28天后，Fap缺失显著降低了TAD的发生率、主动脉破裂率和死亡率。这些结果表明，Fap缺失通过减轻早期炎症反应和ECM降解来预防TAD的发展。

3.4 FAP酶活性的药理学抑制不足以预防BAPN诱导的TAD

使用高特异性FAP蛋白酶活性抑制剂Ac-Gly-BoroPro处理小鼠。虽然该抑制剂能有效抑制FAP的蛋白酶活性，但并未能减轻BAPN诱导的主动脉炎症、ECM降解，也未能阻止TAD的形成。这一出乎意料的结果提示，FAP可能通过非酶促机制在TAD中发挥作用。

3.5 FAP⁺成纤维细胞通过涉及PLAUR和ITGB1的配体-受体相互作用与IL1B⁺巨噬细胞通讯

对Fap^Postn小鼠成纤维细胞的转录组分析发现，Fap敲除导致与免疫反应调节和质膜信号受体复合物相关的通路显著下调。通过分析人TAD单细胞数据（GSE213740）发现，与正常样本相比，TAD样本中FAP⁺成纤维细胞与巨噬细胞（尤其是促炎性的IL1B⁺巨噬细胞亚群）之间的相互作用显著增强。进一步的信号通路分析表明，PLAUR和ITGB1信号通路在FAP⁺成纤维细胞（作为信号发送细胞）与IL1B⁺巨噬细胞（作为信号接收细胞）的通讯网络中显著上调。免疫荧光染色在人和小鼠TAD病变组织中验证了FAP、PLAUR和ITGB1的空间共定位。

3.6 FAP通过非酶促位点介导的结合巨噬细胞PLAUR驱动炎症和ECM降解

分子对接和分子动力学模拟预测了FAP与PLAUR的结合构象及关键作用残基。实验方面，构建了针对预测相互作用界面的多位点突变体FAP^mutant以及针对酶活位点的突变体FAP^S624A。表面等离子共振（SPR）和免疫共沉淀实验证实，野生型FAP（FAP^WT）和酶活缺陷型FAP^S624A均能与PLAUR结合，而FAP^mutant则完全丧失了结合能力。在成纤维细胞-巨噬细胞共培养体系中，FAP^mutant（而非FAP^WT或FAP^S624A）破坏了FAP与PLAUR的相互作用，并且未能像后两者那样促进巨噬细胞的促炎极化（表现为iNOS、CCR2、IL-1β、IL-6等标志物表达降低）。体内实验进一步证实，在Fap^?/?小鼠的成纤维细胞中特异性回补FAP^mutant，无法像回补FAP^WT或FAP^S624A那样加重BAPN诱导的早期主动脉炎症和ECM退化。

3.7 成纤维细胞来源的FAP通过PLAUR/ITGB1/FAK通路调控巨噬细胞促炎表型

RNA-seq分析显示，与FAP过表达的成纤维细胞共培养后，巨噬细胞中与整合素复合物、黏着斑相关的基因以及NF-κB、MAPK等促炎信号通路显著富集。进一步的机制实验表明，成纤维细胞过表达FAP能增强巨噬细胞中FAK、p65（NF-κB亚基）、JNK和ERK的磷酸化水平。当使用siRNA敲低巨噬细胞的PLAUR表达后，这种激活效应被阻断。而使用ITGB1激动剂Vnp-16处理，则可以逆转因PLAUR敲低导致的信号抑制，恢复下游通路的活化。这表明FAP通过与PLAUR结合，促进了PLAUR-ITGB1复合物的组装，进而激活ITGB1/FAK轴及其下游的NF-κB和MAPK信号通路，最终导致巨噬细胞促炎因子分泌增加。

3.8 ITGB1/FAK通路介导FAP调控的TAD发病机制

在Fap^?/?小鼠中，使用ITGB1激动剂Vnp-16处理，可以逆转Fap缺失对TAD的保护作用，表现为TAD发生率、死亡率回升，并且主动脉巨噬细胞中iNOS和磷酸化FAK（p-FAK）的表达增加。相反，通过腺相关病毒（rAAV9）在巨噬细胞中特异性敲除Itgb1（rAAV-F4/80-Itgb1-KO），则能显著降低BAPN诱导的TAD发生，并减少巨噬细胞中iNOS和p-FAK的表达。这些结果证实，ITGB1/FAK信号通路是FAP/PLAUR相互作用下游的关键效应轴，介导了FAP对TAD进展的调控。

4 讨论

本研究阐明了成纤维细胞来源的FAP在TAD中的新功能。与在其他心血管疾病（如心力衰竭、动脉粥样硬化）中主要发挥酶解功能不同，FAP在TAD中主要通过其非酶促功能发挥作用。它作为成纤维细胞与巨噬细胞间通讯的关键分子，通过直接结合巨噬细胞表面的PLAUR，激活ITGB1/FAK信号通路，驱动巨噬细胞向促炎表型极化，进而加剧炎症反应和ECM降解，最终促进TAD发生。这一发现为理解TAD的细胞间互作机制提供了新见解，并提示靶向破坏FAP/PLAUR相互作用，而非抑制FAP的酶活性，可能成为治疗TAD的新策略。

5 结论

成纤维细胞来源的FAP通过非酶促机制直接与巨噬细胞的PLAUR结合，激活ITGB1/FAK信号通路，从而促进巨噬细胞促炎极化，驱动胸主动脉夹层（TAD）的进展。靶向干预FAP/PLAUR相互作用或下游信号通路，有望为TAD的治疗提供新的思路。