《Advanced Science》：MicroRNA-375-3p Targets Fatty Acid Synthase and Relish to Regulate Energy Allocation During Pupal Metamorphosis and Starvation
编辑推荐：
本文揭示了昆虫在蛹期变态和饥饿这两种能量匮乏条件下，一个由FOXO转录因子驱动的核心调控通路。研究发现，miR-375-3p在激素（20E和胰岛素）信号诱导下上调，通过靶向抑制脂肪酸合酶(FASN)和新翅杆状蛋白(Relish)，协同抑制新生脂肪生成、促进脂解、降低免疫反应并增强抗氧化能力，从而将能量优先分配给中枢神经系统等关键生命活动。这项研究阐明了一种由microRNA（miRNA）介导的、用于应对发育和营养胁迫的代谢适应通用机制，为理解能量稳态调控和代谢疾病提供了新视角。
miR-375-3p是赤拟谷盗蛹期变态的关键调控因子
前期的小RNA测序发现，在赤拟谷盗的三个发育阶段中，有550个差异表达的miRNA。其中，miR-375-3p的变化最为显著：在1日龄蛹(EP)中表达量很低，但从6日龄蛹(LP)到1日龄成虫(EA)阶段显著上调。qPCR分析证实，miR-375-3p在EP中表达量极低，而在LP和EA中大量表达，并在LP的脂肪体、表皮和肠道中定位明显。原位杂交显示，从1日龄到6日龄蛹，miR-375-3p表达逐渐增加。功能研究显示，注射miR-375-3p模拟物(mimics)导致33.3%的蛹无法完成羽化，而注射其抑制剂(antagomir)则导致98.9%的蛹无法启动羽化。这些结果共同证明miR-375-3p是赤拟谷盗蛹期变态的关键调节因子。
miR-375-3p在赤拟谷盗的饥饿响应中起关键作用
蛹期变态的一个显著特征是无法从外部获取能量，其调控涉及20-羟基蜕皮酮(20E)。例如，在棉铃虫中，饥饿作为一种外部诱导的营养缺乏状态，也涉及20E介导的调控。这两种能量缺乏状态之间的相似性引出一个问题：miR-375-3p是否在不同能量匮乏状态的能量调控中扮演保守角色？为了验证，研究对高代谢需求的15日龄幼虫进行饥饿处理并注射miR-375-3p的模拟物或抑制剂。结果显示，在miR-375-3p被敲低的饥饿组中，幼虫在15天内死亡率接近100%，而喂食组则无显著差异。qPCR分析显示，饥饿48小时后，幼虫和成虫体内的miR-375-3p均显著上调。原位杂交进一步证实，在饥饿条件下，miR-375-3p在能量分配的关键器官——肠道和脂肪体中的表达增加。这些发现表明，miR-375-3p通过促进能量分配和增强生存能力，成为饥饿响应的关键调节因子。
miR-375-3p直接靶向FASN和Relish
为了找出与miR-375-3p生物学效应相关的靶基因，研究者结合了转录组分析和生物信息学预测。从注射antagomir-375-3p与对照的甲虫转录组差异表达基因(DEGs)中，筛选出157个候选靶基因。KEGG富集分析进一步缩小了范围。利用miRanda和RNAhybrid算法预测结合位点，并结合qPCR验证，最终锁定脂肪酸合酶(FASN)和Relish为潜在靶标，因为只有它们的表达在注射antagomir-375-3p后上调，在注射mimics-375-3p后下调。RNA免疫沉淀(RIP)实验证实，与对照相比，来自注射了mimics-375-3p甲虫的Ago1蛋白免疫沉淀的RNA中，FASN和Relish的mRNA显著富集。研究在FASN和Relish的编码序列(CDS)中发现了潜在的miR-375-3p结合位点。双荧光素酶报告基因实验表明，共转染miR-375-3p模拟物与含有预测结合位点的FASN或Relish CDS区域会显著降低荧光素酶活性，而突变结合位点后活性恢复。原位杂交和免疫荧光实验进一步揭示了miR-375-3p与FASN和Relish在晚期蛹组织中的共定位。这些结果确凿地证明了FASN和Relish是miR-375-3p在赤拟谷盗中的直接靶标。
miR-375-3p通过负调控FASN和Relish介导脂质代谢
在果蝇中，FASN在新生脂肪生成(DNL)中起核心作用，而Relish通过抑制Brummer (Bmm)的表达来调节甘油三酯(TAG)的脂解。基于这些线索，研究者假设miR-375-3p可能通过靶向FASN和Relish来调节脂质代谢。检测了不同处理组幼虫和蛹脂肪体及肠道中的TAG含量。在脂肪体中，与对照组相比，抑制miR-375-3p显著增加了TAG水平，而同时敲低FASN和Relish则逆转了这种增加。在肠道中，所有处理在蛹期和饥饿组都大幅降低了TAG水平。有趣的是，尽管在蛹期也进行了miR-375-3p抑制处理，TAG水平仍显著下降，这可能归因于肠道脂质吸收受损。脂滴染色进一步证实，抑制miR-375-3p会增加脂滴积累，而同时敲低FASN或Relish则可逆转此效应。在喂食条件下，敲低FASN和Relish导致TAG水平显著下降，同时伴随体长减少，但体重增加率保持稳定。脂滴染色显示，在喂食和饥饿条件下，脂滴大小均显著减小，表明脂质储存能力受损。这些结果共同表明，miR-375-3p通过调控其直接靶标FASN和Relish来介导脂质代谢，尤其是在能量匮乏状态下。
miR-375-3p在蛹期或饥饿条件下维持低水平的免疫应答和氧化应激
鉴于Relish是关键免疫转录因子，研究进一步探究了miR-375-3p是否影响免疫反应。用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染赤拟谷盗，实验在蛹期、喂食和饥饿条件下进行。结果显示，在蛹期和饥饿条件下沉默miR-375-3p会显著降低菌落计数，而Relish及相关抗菌肽(AMPs)的表达显著上调。在喂食组，过表达miR-375-3p则导致菌落计数显著增加，同时Relish及相关抗菌肽的表达下调。转录组数据表明，过氧化氢酶(CAT)的表达在miR-375-3p调控下显著下降，提示其参与氧化应激调节。在饥饿幼虫和蛹中，敲低miR-375-3p显著降低了CAT活性和总抗氧化能力(T-AOC)。相反，在喂食幼虫中，过表达miR-375-3p则增加了CAT和T-AOC活性。活性氧(ROS)水平检测（通过H2DCFH染色）显示出相反的趋势：在蛹和饥饿组，敲低miR-375-3p大幅增加了ROS，而在喂食组过表达它则降低了ROS水平。这些结果表明，miR-375-3p在蛹期和饥饿这两种能量匮乏状态下，维持了低水平的免疫反应和氧化应激。
miR-375-3p在蛹期或饥饿条件下优先向中枢神经系统供应ATP
qPCR结果显示，在饥饿和蛹期变态期间，FASN和Relish在中枢神经系统(CNS)中高表达。研究发现，在喂食幼虫中，抑制miR-375-3p会显著提高整体ATP含量，但在蛹期和饥饿幼虫中则没有。为了检查能量分配，评估了6日龄蛹以及喂食和饥饿处理48小时后的15日龄幼虫各组织中的ATP分布。在蛹和饥饿幼虫中，敲低miR-375-3p增加了CNS中的ATP含量，但降低了脂肪体和肠道中的ATP含量。在喂食幼虫中，敲低miR-375-3p增加了CNS、肠道和脂肪体中的ATP含量。这种重新分配可能反映了一种生理适应，即miR-375-3p作为能量分配的核心调节因子，协调不同组织间脂质代谢和ATP产生的平衡，特别是在饥饿和蛹期变态等能量匮乏条件下，调节中枢神经系统和肠道的能量代谢。
FOXO直接结合miR-375-3p启动子，在蛹期和饥饿条件下调控免疫反应和氧化应激
与传统的mRNA基因不同，miRNA的启动子区域在赤拟谷盗中知之甚少。为了克服这一限制，研究者采用了一种初级miRNA (pri-miRNA)富集方法，即使用RNA干扰(RNAi)敲低赤拟谷盗的drosha转录本来富集pri-miRNA。然后，利用dsDrosha处理甲虫的总RNA进行5‘-cDNA末端快速扩增(5’-RACE)，以鉴定新的pri-miRNA及其潜在的转录起始位点(TSS)。qPCR分析表明，注射其dsRNA后，Drosha转录本减少了60%。研究确定了miR-375的TSS位于前体miR-375-3p上游733个碱基的一个鸟嘌呤(G)处。利用Jaspar数据库分析了其启动子上游1.5kb的序列以预测潜在的结合位点。在蛹期第3天，研究者敲低了9个预测的转录因子，并在48小时后评估敲低效率和miR-375表达。所有9个敲低都成功，但只有SREBP或FOXO的敲低在蛹期显著降低了miR-375-3p的表达。在喂食条件下，敲低SREBP或FOXO会降低miR-375-3p的表达；然而，在饥饿幼虫中，只有FOXO的敲低降低了其表达。与敲低miR-375-3p类似，沉默FOXO也导致TAG含量和脂滴大小显著增加。
研究者将miR-375-3p上游调控区域（-1499至+23）克隆到pGL3 Basic荧光素酶报告载体中。将SREBP和FOXO的编码序列(CDS)克隆到pAc5.1载体中，并共转染到果蝇Schneider 2 (S2)细胞中。在培养基中添加10% PBS模拟饥饿，对照组添加10%胎牛血清(FBS)。同时，在正常培养条件下，用20-羟基蜕皮酮(20E)处理细胞以模拟蛹后期，并加入乙醇作为对照。在转染了pAc5.1-FOXO的组中，与FBS和乙醇对照组相比，PBS和20E处理下的S2细胞荧光素酶活性显著增加。相反，pAc5.1-SREBP组荧光素酶活性没有显著变化。这些结果表明，在20E刺激和饥饿条件下，FOXO显著增强了miR-375-3p的调控。
为了研究FOXO在饥饿和蛹期变态过程中对miR-375-3p的体内转录调控，研究者根据Jaspar数据库的预测，设计了两个针对FOXO结合位点的染色质免疫沉淀-qPCR (ChIP-qPCR)引物。实验组包括饥饿vs.喂食条件以及早期vs.晚期蛹期。结果显示，在所有条件下，第一个结合位点的FOXO结合没有显著变化。然而，在饥饿条件下和蛹晚期，FOXO对第二个位点的结合显著增强。电泳迁移率变动分析(EMSA)证实，第二个结合位点与纯化的FOXO重组蛋白相互作用。突变该位点大大降低了与FOXO和启动子区域相关的荧光素酶活性。这些发现表明，FOXO结合到miR-375-3p启动子的TAAAAACAC序列上，并且其活性在蛹期变态和饥饿条件下增强。
为了测试FOXO是否能通过miR-375-3p调控下游免疫反应和氧化应激，研究者在蛹期和饥饿条件下敲低了FOXO，并使用miR-375-3p模拟物进行拯救实验。在大肠杆菌处理下，注射dsFOXO后，蛹期和饥饿条件下的菌落计数均下降，随后添加miR-375-3p模拟物部分恢复了菌落计数。在金黄色葡萄球菌处理下，注射dsFOXO后，蛹期和饥饿条件下的菌落计数也下降。然而，只有在饥饿条件下，后续添加miR-375-3p模拟物才导致恢复，在蛹期则未观察到显著效果。这种差异可能归因于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌不同的感染和防御机制。此外，CAT和T-AOC的酶活性测定显示，在蛹期和饥饿条件下敲低FOXO导致抗氧化能力显著下降，而添加miR-375-3p模拟物则使这种下降得到部分恢复。
FOXO响应激素信号调节miR-375-3p表达
FOXO转录因子受到信号通路的严格调控，特别是胰岛素/胰岛素样生长因子信号(IIS)通路和20E通路。研究者旨在探究在蛹期和饥饿条件下，FOXO是否响应这两种激素的诱导，以及FOXO是否介导这些激素对下游miR-375-3p的调控。qPCR结果显示，在蛹期，20E信号对miR-375-3p表达的调控占主导地位，优于胰岛素信号。然而，在喂食和饥饿期间，20E和胰岛素都通过FOXO调控miR-375-3p的表达。通过免疫荧光分析检测FOXO的核转位。与qPCR结果一致，在羽化期，FOXO主要响应20E信号通路的激活，使其能够入核调控miR-375-3p。在饥饿条件下，胰岛素信号通路的抑制与20E信号通路的激活共同诱导FOXO转位至细胞核并调控下游基因。这些发现强调了20E和胰岛素在蛹期、喂食和饥饿期间通过不同模式（独立或协同）调节FOXO活性。
能量匮乏诱导的miR-375高表达在昆虫中是保守的
为了验证能量匮乏诱导的miR-375-3p高表达是否具有保守性，研究者选择了两种昆虫进行进一步研究：不完全变态昆虫绿盲蝽和完全变态昆虫黑腹果蝇。绿盲蝽饥饿24小时后死亡率接近100%，黑腹果蝇饥饿2天后死亡率接近100%。因此，测量了绿盲蝽在饥饿后0、3、6、9和12小时，以及黑腹果蝇在饥饿后0、6、12和24小时以及蛹期的miR-375-3p表达水平。在饥饿条件下，绿盲蝽和黑腹果蝇中miR-375-3p的表达水平均显著增加。此外，在黑腹果蝇的蛹期，miR-375-3p的表达也显著升高。这些结果为miR-375-3p可能在能量匮乏条件下作为保守的调控轴发挥作用提供了初步证据。
讨论与总结
高效的能量供应和分配是所有生物体生存和正常功能的基础。在进化史上，能量匮乏是一个反复出现的挑战，推动了生物在资源有限条件下确保生存的适应机制的发展。昆虫占所有动物物种的75%，是动物界最多样化和最成功的类群之一，为理解能量分配策略提供了有价值的模型。本研究以赤拟谷盗为模型生物，揭示了miR-375-3p在两种能量匮乏条件（蛹期变态和饥饿）下调控能量分配的关键作用。蛹期变态诱导20E上调，而饥饿则促进20E水平并抑制胰岛素水平。关键转录因子FOXO整合了这些激素变化触发的信号级联，转位至细胞核，并上调miR-375-3p的表达。此外，miR-375-3p直接靶向FASN和Relish，并间接影响CAT水平，从而确保在能量匮乏条件下生长与维持之间的平衡。
研究进一步证明，细胞内能量状态与miR-375-3p表达呈负相关。值得注意的是，miR-375在肝细胞癌、胃癌、乳腺癌和食管癌等肿瘤中经常下调。在恶性肿瘤中，脂质代谢通常被重编程以满足癌细胞的高能量需求和快速增殖：新生脂肪生成上调，FASN通常过表达以确保充足的脂肪酸供应，用于膜生物合成、ATP产生和信号脂质合成。尽管实验是在能量剥夺条件下进行的，而不是肿瘤典型的能量丰富、脂肪生成驱动的环境，但同样观察到miR-375-3p的显著上调。这表明细胞能量状态的转变通过负反馈机制触发miR-375-3p。此外，这使我们假设，miR-375-3p在调节脂质代谢中的作用可能构成跨物种广泛保守的机制。
除了miR-375-3p在能量分配中的作用，研究者还探索了潜在的上游转录调节因子。他们确定了两个潜在因子，其中FOXO显示出与miR-375-3p启动子的结合活性，而SREBP则没有。SREBP仅在喂食期间结合FASN启动子，禁食后结合消失。这表明FOXO在能量稀缺条件下介导miR-375-3p的转录，而SREBP主要在喂食期间调节脂质代谢。
总而言之，本研究鉴定出一个激素响应的FOXO–miR-375-3p转录轴，作为能量匮乏条件下系统性能量分配的核心调节因子。该轴将FOXO介导的激素输入与miR-375-3p对关键代谢和应激反应基因的转录后控制联系起来，在能量匮乏条件下将资源重新导向发育和生存途径。这一机制也可能扩展到不同物种，并有望成为预防和治疗代谢性疾病及肿瘤的靶点。
