《Advanced Science》：Real-Time Visualization of Isoform-Specific RAF-KRAS Interactions in Living Cells Using FRET-BRET Hybrid Biosensors
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本研究开发了基于FRET（荧光共振能量转移）和BRET（生物发光共振能量转移）的杂交生物传感器，首次实现活细胞内KRAS突变体与RAF亚型互作的实时、定量监测，为靶向RAS信号通路的抗癌药物研发提供关键技术平台。
1 引言：破解KRAS-RAF互作动态监测的技术瓶颈
在细胞信号传导网络中，RAS-RAF-MEK-ERK通路是调控增殖、分化与存活的核心枢纽，其异常活化与30%的实体瘤密切相关。KRAS作为“癌基因之王”，其G12位点突变（如G12C/D/V）可锁定GTP结合态，导致RAF激酶持续活化。然而，传统生化方法（如SPR、ITC）难以捕捉活细胞内的瞬时互作，而单模态FRET传感器易受光漂白干扰，BRET则存在光子产率低的局限。本研究通过构建FRET-BRET杂交传感器（HRK），突破时空分辨率限制，首次实现RAF亚型（ARAF/BRAF/CRAF）与KRAS突变体互作的动态解析。
2 结果：从传感器构建到临床转化潜力验证
2.1 FRK传感器揭示RAF亚型特异性互作动力学
通过连接ECFP（供体）与mNeonGreen（受体），构建含RAF-RBD（RAS结合域）的FRK传感器。EGF刺激后，FRK-A（ARAF-RBD）在10分钟达峰值，响应幅度显著高于FRK-B/C（p< 0.0001），其FRET/CFP比值提升1.8倍，且光谱分析显示517 nm处发射强度增加40%。该结果证实ARAF对KRAS激活最敏感，而BRAF在静息状态下已存在较高基础结合（图1）。
2.2 可逆互作监测与抑制剂特异性验证
采用吉非替尼（EGFR抑制剂）和MCP110（CRAF特异性抑制剂）干预，发现FRK-A/B对吉非替尼敏感（t1/2= 8.2分钟），而FRK-C对MCP110响应显著（t1/2= 7.5分钟），证明传感器可区分上游信号阻断与直接互作抑制（图2）。
2.3 双模HRK传感器拓展应用场景
引入NanoLuc（Nluc）构建HRK，保留FRET灵敏度的同时新增BRET模式。HRK-A在EGF刺激后FRET/CFP比值提升1.7倍，BRET光谱517 nm处信号增强35%，且与FRK性能无统计学差异（p> 0.05），支持其在低背景、高通量筛选中的应用（图3）。
2.4 KRAS突变体呈现特征性结合模式
G12V传感器基础FRET比值最高（较野生型高60%），G12D次之，S17N（GDP锁定突变体）几乎无响应。动态监测显示突变体对EGF刺激无显著反应，证实其GAP（GTP酶激活蛋白）抵抗特性（图4）。
2.5 实时监测等位基因选择性抑制
索托拉塞（Sotorasib，G12C特异性抑制剂）处理HRK-A-G12C，5分钟内FRET/CFP比值下降45%；MRTX1133（G12D偏好性抑制剂）对G12D抑制率达70%，但对G12C/V亦有30%抑制效果，提示其潜在广谱活性（图5）。
2.6 微孔板筛选揭示抑制剂效价差异
剂量反应曲线显示，索托拉塞对G12C的IC50为1.20 nM，MRTX1133对G12D的IC50为21.62 nM，而BI-2865（泛KRAS抑制剂）对各突变体IC50均低于90 nM，为临床联合用药提供依据（图6）。
3 讨论：技术突破与临床启示
HRK传感器通过双模检测实现四大创新：（1）首次在活细胞中解析ARAF/BRAF/CRAF与KRAS的亚型特异性互作；（2）捕捉G12突变体的基础结合增强与GAP抵抗现象；（3）揭示MRTX1133对非G12D突变体的交叉抑制；（4）证实传感器在细胞裂解液与活细胞中数据一致性。该平台为KRAS靶向药物的耐药机制研究、联合疗法设计及个体化治疗提供关键技术支撑。
4 实验方法要点
采用HeLa与Lenti-X 293T细胞系，通过PEIpro转染构建传感器，激光共聚焦显微镜（Leica DMi8）监测FRET/CFP动态变化，CLARIOstar Plus微孔板仪进行光谱分析。所有数据经背景校正与归一化处理，统计方法包括t检验与ANOVA（GraphPad Prism 10.1.2）。
5 结语
本研究构建的FRET-BRET杂交传感器，如同给细胞安装了“分子高速摄像机”，首次实现KRAS突变体与RAF亚型互作的毫秒级动态追踪。其揭示的等位基因特异性抑制规律与抑制剂交叉活性，为攻克“不可成药”靶点KRAS提供全新工具与理论依据。
