《Advanced Science》：Illuminating Mitochondrial RNA G-Quadruplexes as Structural Brakes on RNA Granule Assembly and OXPHOS
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本研究介绍了一种新型荧光探针MitoQUMA，首次实现了活细胞内线粒体RNA G-四链体（mtRNA G4s）的可视化。研究发现，与通常促进相分离的胞质RNA G4s不同，过量的mtRNA G4s形成会抑制线粒体RNA颗粒（MRGs）的组装。研究揭示了Wnt/β-catenin信号通路通过调控GRSF1表达来影响mtRNA G4丰度及RNA加工，从而协调MRG组装、线粒体基因表达和氧化磷酸化（OXPHOS），为理解线粒体内相分离及其与细胞能量代谢和肿瘤增殖的关联提供了全新视角。
1 引言
线粒体是细胞能量代谢和生物合成的核心枢纽，其正常功能依赖于线粒体基因组（mtDNA）的精确表达。人类mtDNA编码37个基因，这些基因转录产生的线粒体RNA（mtRNA）对氧化磷酸化（OXPHOS）核心组分的表达至关重要。在众多能影响RNA代谢和基因表达的结构元件中，G-四链体（G4s）受到了广泛关注。它们是由富含鸟嘌呤（G-rich）的序列通过Hoogsteen氢键折叠形成的稳定四链结构。生物信息学分析表明，线粒体基因组中含有丰富的潜在G4形成序列（PQSs）。然而，关于mtRNA G4s的认知大多来源于体外研究，缺乏在活细胞中直接观测的有效工具，这限制了对其他理学功能的深入理解。与已存在分子探针的核DNA G4s、胞质RNA G4s和线粒体DNA G4s相比，mtRNA G4s的研究仍是一片空白。因此，开发能够可视化细胞内mtRNA G4s的探针，对于理解线粒体基因调控和细胞代谢具有迫切的科学意义和重大挑战。
2 结果与讨论
2.1 用于活细胞成像mtRNA G4s的荧光探针的理性设计
为靶向线粒体基质，研究团队基于此前开发的胞质RNA G4s特异性探针QUMA-1进行理性结构修饰。线粒体具有磷脂双分子层和负膜电位（约-150至-180 mV），因此靶向线粒体的小分子通常需要高亲脂性和离域正电荷。研究首先尝试引入广泛使用的线粒体靶向载体三苯基鏻（TPP+）基团，合成了TPP-QUMA。然而，活细胞成像显示，TPP-QUMA虽能定位至线粒体，但其部分点状信号与mtDNA指示剂PicoGreen显著共定位，表明其增强了与mtDNA的结合而非特异性靶向mtRNA。因此，研究团队调整了修饰策略，通过在QUMA-1的C2位点引入一系列具有不同亲脂性和质子化潜力的脂肪胺侧链，合成了五个衍生物Q1-Q5。通过共聚焦显微镜评估，发现Q5（随后命名为MitoQUMA）在进入线粒体的同时，显示出独特的点状信号，与线粒体追踪剂（MitoTracker Green）的皮尔逊相关系数（PCC）高达0.93，且与PicoGreen标记的mtDNA共定位极低，表明其与mtDNA相互作用最小。
2.2 MitoQUMA作为mtRNA G4s荧光探针的评估
体外荧光光谱分析显示，MitoQUMA单独在缓冲液中荧光发射可忽略不计，而在加入mtRNA G4s后，630 nm处荧光显著增强，对单链或双链mtRNA的反应则较弱，表明其体外对G4结构有更高响应性。细胞层面验证显示，MitoQUMA具有强光稳定性和低细胞毒性。RNase A处理可完全消除其信号，而DNase I处理无显著影响，证明其在细胞内主要与RNA结合。在缺乏mtDNA的ρ0细胞中，MitoQUMA荧光显著减弱。用线粒体转录抑制剂IMT1处理会显著降低MitoQUMA荧光，但不影响PicoGreen信号；而用翻译抑制剂氯霉素处理则无影响，进一步证实MitoQUMA优先与mtRNAs结合。竞争实验表明，已知的线粒体G4配体RHPS4可减少MitoQUMA的点状信号和总荧光强度。通过离子载体缬氨霉素（诱导K+内流）和离子霉素（诱导K+外流）调节线粒体K+水平发现，增加K+可增强MitoQUMA荧光，反之则抑制，这与G4结构对K+的敏感性一致。过表达GFP标记的GRSF1（已知可解开mtRNA G4s的蛋白）显著降低了MitoQUMA荧光，且红色MitoQUMA信号与绿色GRSF1焦点显著共定位；反之，siRNA敲低GRSF1则增强了MitoQUMA荧光。这些结果共同证明，MitoQUMA能够选择性可视化活细胞中的mtRNA G4s。
2.3 线粒体RNA G4s调控相分离线粒体RNA颗粒的组装
GRSF1是定位于线粒体基质的RNA结合蛋白，也是线粒体RNA颗粒（MRGs）的核心组分。MRGs是由新转录的mtRNAs和多种RNA结合蛋白组成的动态液-液相分离结构，对mtRNA加工、成熟和线粒体核糖体组装至关重要。研究观察到MitoQUMA标记的mtRNA G4s与GRSF1以及经典的MRG标记蛋白FASTKD2显著共定位。活细胞实时成像进一步显示，mtRNA G4s与FASTKD2指示的MRGs具有相关的运动轨迹和动态的融合-分裂事件，表明mtRNA G4s嵌入MRGs中，并可能通过相分离参与其组装。有趣的是，功能研究得出了与胞质RNA G4s相反的结果：胞质RNA G4s通常作为支架促进相分离和RNA颗粒形成，而mtRNA G4s却阻碍MRG的组装。在较高浓度（20和50 μM）的MitoQUMA处理下，FASTKD2焦点数量显著减少。同样，敲低促进mtRNA G4形成的GRSF1也会导致MRG数量显著下降。这些结果表明，mtRNA G4的形成可能阻碍MRG组装。研究推测，MRG是新生mtRNA加工和成熟的枢纽，其组装与高效的mtRNA加工紧密耦合。过早或过量的G4折叠可能形成结构屏障，阻碍RNA结合蛋白的正常结合及随后的mtRNA加工。当加工受损时，mtRNA成熟受阻，MRG变得不稳定并发生解组装。高剂量MitoQUMA处理导致了线粒体L链转录本（如lncCYTB和lncND5）的显著积累，并广泛下调了编码13个核心线粒体呼吸链蛋白的mRNAs。
2.4 化学遗传学筛选鉴定出调控癌细胞中MRG组装的Wnt/β-catenin–GRSF1–mtRNA G4轴
为了探索细胞如何控制mtRNA G4折叠和MRG组装，研究利用MitoQUMA作为活细胞成像工具，在HeLa细胞中设计了一种高内涵化学遗传学筛选方法，以识别调节mtRNA G4形成的信号通路。研究筛选了一个包含167种抑制剂的库，这些抑制剂靶向已知影响线粒体功能的通路，并使用先前验证的线粒体核酸探针MitoTO作为内参对照，以区分特异性调节mtRNA G4折叠的化合物。筛选结果显示，只有Wnt/β-catenin通路抑制剂ICG-001满足筛选标准，它引起MitoQUMA荧光最显著的增加，而对MitoTO影响极小，表明Wnt/β-catenin信号可能是影响mtRNA G4丰度的调节通路。验证实验证实，ICG-001剂量依赖性地增加mtRNA G4数量，而Wnt/β-catenin激动剂BML-284则抑制MitoQUMA信号。进一步研究发现，ICG-001显著降低而BML-284增加GRSF1的mRNA和蛋白水平。此外，BML-284处理可以挽救由GRSF1敲低诱导的mtRNA G4积累和MRG减少。这些结果证明，Wnt/β-catenin信号通过GRSF1调节mtRNA G4折叠和MRG组装，从而突显了Wnt/β-catenin–GRSF1–mtRNA G4轴作为MRG组装的关键调节通路。
2.5 增强的mtRNA G4形成破坏MRG组装，损害线粒体呼吸并抑制细胞增殖
研究进一步考察了调节Wnt/β-catenin–GRSF1–mtRNA G4轴对mtRNA稳态和细胞功能的影响。用ICG-001处理（通过抑制Wnt/β-catenin增加mtRNA G4丰度并减少MRG数量）或敲低GRSF1，均导致线粒体L链转录本（如lncCYTB和lncND5）异常积累，并显著下调编码13个关键线粒体呼吸链蛋白的mRNAs。作为这种线粒体基因表达抑制的后果，ICG-001或高剂量MitoQUMA处理导致细胞耗氧量显著下降，基础呼吸和ATP产生均减少，这与OXPHOS受损一致。在GRSF1敲低细胞中也观察到类似结果。相应地，ICG-001处理、高剂量MitoQUMA处理和GRSF1敲低均不同程度地抑制了HeLa细胞的增殖。这项研究将Wnt/β-catenin–GRSF1–mtRNA G4轴定义为一条先前未被识别的调控通路，它控制着MRG组装、线粒体基因表达、OXPHOS活性，并最终影响癌细胞增殖。
3 结论
本研究在先前开发并商业化的胞质RNA G4探针QUMA-1的基础上，通过理性结构修饰和成像筛选，成功开发了首个能够在活细胞中可视化mtRNA G4s的荧光探针MitoQUMA。利用该工具，研究揭示了mtRNA G4s与线粒体RNA颗粒（MRGs）组装之间的密切关联，并发现与胞质RNA G4s通常促进相分离不同，mtRNA G4s的形成反而会阻碍MRG的组装。这反映了MRGs作为组成性mtRNA加工平台与应激诱导的胞质应激颗粒（SGs）在功能上的根本差异。此外，通过建立基于MitoQUMA的化学遗传学筛选平台，研究鉴定出Wnt/β-catenin–GRSF1–mtRNA G4轴是一条全新的调控通路，它通过控制MRG组装来影响线粒体基因表达、OXPHOS活性和癌细胞增殖。这项工作不仅提供了一种研究mtRNA G4s的强大化学工具，也为理解信号通路如何通过调节RNA二级结构和相分离来直接影响线粒体基因调控和能量代谢开辟了新途径，对靶向癌症代谢等领域具有潜在意义。
4 实验部分
（此部分详细描述了研究中使用的化合物、寡核苷酸、细胞系、荧光光谱、活细胞与固定细胞成像、化学遗传学筛选、耗氧率测定及统计分析方法，为研究的可重复性提供了详细的技术方案。）
