《Advanced Science》：Versatile CRISPR-Cas Tools for Gene Regulation in Zebrafish via an Enhanced Q Binary System
1 引言
基因表达调控是理解靶基因功能的核心。CRISPR-Cas9系统已在斑马鱼中广泛应用于多种基因修饰。然而，转录敲低技术长期依赖吗啉寡核苷酸（MO），但其存在毒性和脱靶效应。虽然CRISPRi（CRISPR interference）能抑制转录活性，但在合子基因激活前，胚胎发生早期依赖于母源mRNA，这是CRISPRi无法控制的。Cas13（一种Ⅱ类VI型CRISPR-Cas RNA内切核酸酶）能诱导RNA降解，其中CasRx（即RfxCas13d）在斑马鱼胚胎中能高效下调特定mRNA转录本且无明显毒性。
尽管如此，大多数斑马鱼实验仍依赖向胚胎注射mRNA或纯化的Cas效应蛋白及一个或多个向导RNA（gRNA）。然而，理解靶基因的分子机制或模拟人类疾病通常需要能进行组织特异性或时间控制的转基因动物。虽然转基因Cas9斑马鱼已用于基因敲除（KO），但尚未有文献记载能实现可控基因激活、下调或转录敲低的转基因CRISPR斑马鱼。与Cas9驱动的基因敲除不同，通过CasRx实现转录敲低，或通过CRISPRa/CRISPRi实现基因上下调，需要CRISPR效应蛋白持续高水平表达。注射Cas效应蛋白的mRNA或蛋白只能短暂引入高水平表达，而这些效应蛋白的转基因表达往往不足以诱导所需效果。
二元表达系统为增强基因表达提供了强大方法，并具有组织特异性或时间控制的灵活性。Gal4/UAS系统是果蝇中的主要二元系统，但其在斑马鱼中的实用性受到两个限制：UAS沉默和Gal4毒性。在脊椎动物中，UAS元件内CpG二核苷酸的甲基化积累可导致其沉默。虽然经过修饰的UAS版本显示出减少的杂色斑和基因表达沉默，但在多个世代中UAS启动子的转录沉默仍然存在。为避免GAL4/UAS系统中的甲基化问题，在斑马鱼中引入了无CpG元件（tUAS）和色氨酸阻遏物（TrpR），但该驱动子的过度毒性限制了其使用。
Q二元表达系统源自真菌粗糙脉孢菌，由于QF反式激活子的共有结合位点中缺乏CpG二核苷酸，因此能有效防止CpG介导的甲基化引起的沉默。本研究中，作者团队介绍了一种在转基因斑马鱼中精确、稳健地控制转录敲低和基因激活的方法。这一成就是通过将CRISPR-Cas效应蛋白表达与增强的QFvpr（QF DNA结合域与三个转录激活因子VP64、p65、Rta融合）/QUAS二元表达系统（称为CRISPR-Q系统）相结合实现的。
2 结果
2.1 QFvpr/QUAS系统是优越的二元系统
为了在斑马鱼中开发更强大的二元转基因系统，团队测试了增加VP16重复序列的数量是否能增强转录激活。通过构建一系列Gal4变体进行比较，发现除了VP64活性略有提高外，增加VP16重复序列并未显著提高转录激活。随后，选择VPR（VP64-p65-Rta融合体）作为激活域（AD），因为它包含VP64，并且被证明是跨多种生物体最有效可靠的反式激活因子之一。如预期，体外实验显示Gal4vpr显著提高了荧光素酶报告基因的转录。同样，团队构建了QFvpr反式激活子，在斑马鱼胚胎中测试表明，QFvpr显示出比QF2高得多的报告基因激活能力，且活性与Gal4vpr相当。
接着检测了QFvpr和Gal4vpr在斑马鱼胚胎中的相对毒性。结果显示，注射Gal4vpr的胚胎即使在低浓度（如15皮克）下也无法存活，而大多数胚胎能更好地耐受QFvpr。这些结果表明Gal4 DBD（DNA结合域）本质上比QF DBD更具毒性。随后成功培育出携带ubb:QFvpr-CK的斑马鱼种鱼，但未能建立携带ubb:Gal4vpr-CK的种鱼系。这表明QFvpr与Gal4vpr以及KalTA4相比，毒性显著降低。
团队尝试用QFvpr/QUAS系统驱动CRISPR效应蛋白的表达。在测试中，发现ubb驱动的QFvpr可能导致毒性，且CasRx表达较弱。因此，团队转向使用热激启动子hsp70l驱动的转基因斑马鱼系Tg(hsp70l:QFvpr-CK)。热激处理后，观察到EGFP的明亮表达，表明CasRx的转录激活很强。重要的是，与Gal4/UAS系统不同，在F4代中未发现QFvpr/QUAS二元系统出现基因沉默，这与之前的研究报告一致。
2.2 使用二元表达系统在转基因斑马鱼中进行CRISPR介导的基因调控的实验设计
为了实现CRISPR效应蛋白的稳健可靠表达，团队将QFvpr/QUAS二元系统与由5×QUAS启动子驱动的CRISPR效应蛋白偶联，从而生成CRISPR-Q系统。为了上调内源性基因表达，选择dCas9vpr作为转录激活的效应蛋白。为了通过Cas13蛋白进行转录敲低，团队首先比较了CasRx和Cas13X（即Cas13bt3）的敲低效率，总体上CasRx比Cas13X显示出更强的敲低活性，因此选择CasRx来生成用于转录敲低的转基因斑马鱼。
CRISPR效应蛋白的表达由5×QUAS启动子在结合QF反式激活子后驱动。通过将携带启动子特异性QFvpr和5×QUAS:Cas效应蛋白的双转基因（2Tg）斑马鱼与表达针对CasRx或dCas9的特异性gRNA的另一转基因品系杂交，生成了三转基因（3Tg）斑马鱼。这些3Tg胚胎或幼鱼用于评估RNA表达水平，并与2Tg对照比较对刺激的行为反应。
2.3 CRISPR-Q系统能够在转基因斑马鱼中通过CasRx实现有效的mRNA敲低
为了测试CRISPR-QKD是否能有效敲低斑马鱼中的转录本，团队进行了实验。通过每日短暂热激处理，观察到CasRx的强转录激活。大多数胚胎发育正常，热激处理可在后续几天重复以延长基因调控的持续时间。
通过qPCR检测，在表达针对smn1的gRNA的3Tg斑马鱼中，smn1表达显著降低。团队进一步测试了CRISPR-QKD能否同时敲低来自重复基因的两个mRNA靶点，针对tardbp（tardbp和tardbpl）或gpx4（gpx4a和gpx4b）两个旁系同源基因的3Tg斑马鱼幼鱼，显示这些基因的表达水平均显著降低。RNA-seq分析表明，CRISPR-QKD在smn1和tardbp旁系同源基因的表达上显示出适度的降低，且脱靶敲低有限。Western印迹分析也观察到GPX4蛋白水平显著降低。
团队还评估了CasRx在斑马鱼中的附带活性。共注射CasRx mRNA和靶向mGreenLantern（mGL）的gRNA以及mGL和mKate2的mRNA，发现当mGL mRNA注射量超过50皮克时，mKate2荧光减少，表明存在CasRx介导的附带活性。然而，在表达CRISPR-QKD的转基因鱼中，未检测到附带效应或毒性。这些结果表明，转基因CRISPR-QKD系统不会诱导可检测的附带活性或毒性。
敲低效率受Cas效应蛋白和gRNA表达水平的影响。团队发现，QFvpr/QUAS系统诱导的CasRx mRNA水平与注射300皮克mCasRx的24小时胚胎中的水平相当。有趣的是，从1皮克到100皮克的gRNA注射量诱导了相当的敲低效率，表明10皮克gRNA可能就足够了。此外，将mCasRx注射到gRNA转基因胚胎中可产生显著的敲低效果。这些结果表明，虽然CasRx表达水平和gRNA丰度对整体效率有重要贡献，但靶点选择在敲低效率中也起着重要作用。
转基因拷贝数会影响其表达水平。对CRISPR-QKD系统各组分的拷贝数定量显示，QFvpr为1-2拷贝，CasRx为1-3拷贝，gRNA为3-12拷贝。这些发现表明，CRISPR-Q系统可以通过Tol2系统有效建立。
2.4 CRISPR-QKD介导的smn1敲低导致斑马鱼出现SMA相关表型
SMN蛋白的缺失会导致运动神经元的功能缺陷甚至死亡，引起脊髓性肌萎缩症（SMA）。同样，斑马鱼中smn1的缺失会导致运动神经元和肌肉缺陷、运动活动减少以及母体和合子缺陷情况下4-5天后的早期死亡。通过CRISPR-QKD介导的smn1敲低，团队观察到3Tg幼鱼的双折射性（反映肌肉完整性）轻微但显著降低。在触碰诱发逃逸试验中，与2Tg幼鱼相比，3Tg幼鱼表现出较弱或缓慢的逃逸反应，逃逸距离显著减少。这些缺陷可以通过注射在靶点内含有突变的smn1mRNA来挽救。
为了研究潜在的运动功能缺陷，团队检测了3Tg幼鱼在各种刺激下的运动行为。总体而言，在黑暗条件下以及暴露于紫光时，3Tg幼鱼的运动活动略有但显著降低。同样，3Tg幼鱼在振动惊吓反应试验（VSRA）中也显示出轻微但显著的降低。这些结果表明，CRISPR-QKD介导的斑马鱼smn1敲低足以重现SMA疾病的表型。
2.5 通过CRISPR-QKD双重敲低Tardbp和Tardbpl重现斑马鱼的ALS特征
TDP-43是一种广泛表达的核RNA/DNA结合蛋白，参与多种RNA代谢过程。TDP-43的失调及其细胞质沉积与多种神经退行性疾病有关。在斑马鱼中，虽然tardbp突变体由于存在其旁系同源物tardbpl而没有表现出明显的表型，但tardbp和tardbpl的双重纯合突变体会表现出肌肉、运动神经元和血管系统的各种缺陷，导致7-8天后早期死亡。
鉴于tardbp和tardbpl都能被CRISPR-QKD显著敲低，团队观察到3Tg幼鱼在所有光照条件下的运动活动均显著降低，特别是在黑暗或紫光下。同时，tardbp和tardbpl的双重敲低导致惊吓反应显著降低。此外，通过免疫染色评估3Tg幼鱼的肌肉完整性，发现与2Tg或未热激幼鱼相比，热激处理进行双重敲低的3Tg幼鱼中异常或退化的肌细胞显著增加。总之，通过CRISPR-QKD同时敲低tardbp和tardbpl导致斑马鱼幼鱼出现表型变化，包括肌肉损伤和运动活动受损，这些都是ALS的特征。
2.6 CRISPR-Qa在转基因斑马鱼中有效激活转录
团队研究了dCas9vpr激活剂水平的增加是否能诱导内源性基因的持续转录激活。为此，选择lin28a、myca和sox9b来测试基因激活。为了提高转录激活的概率，为每个基因设计了三个靶向基因近端启动子区域的sgRNA，并将其克隆到一个质粒中，生成3×zU6:sgRNA构建体。
通过每日短暂热激处理，观察到dCas9vpr的显著表达。大多数胚胎发育正常。qPCR结果显示，与2Tg条件相比，3Tg斑马鱼幼鱼中lin28a和sox9b的表达水平显著更高。转录组谱显示lin28a和sox9b显著上调。鉴于sox9b的激活，团队研究了sox9b的上调是否能激活其靶基因。测试了九个据报告受sox9b调控的基因的表达水平，其中四个基因显著上调，其余基因也显示出表达增加的趋势。相比之下，作为阴性对照的sox9a表达保持不变。因此，CRISPR-Qa系统能够充分增强CRISPRa活性，使得在转基因斑马鱼中持续功能性激活内源性基因成为可能。
团队还评估了CRISPR-QKD或CRISPR-Qa的表达是否会诱导细胞应激或死亡。通过TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）试验和应激反应标志基因的RT-qPCR分析，未检测到细胞死亡或应激反应。
2.7 CRISPR-Q有效调节幼年和成年斑马鱼的基因表达
斑马鱼为高通量筛选、药物发现和体内成像提供了多种优势。团队测试了CRISPR-Q系统是否能在年龄较大的鱼中实现有效的基因调节。在幼年和成年2Tg和3Tg斑马鱼中进行CRISPR-QKD和CRISPR-Qa实验，随后进行热激处理。观察到显著的GFP荧光，表明CasRx或dCas9vpr的稳健表达。重要的是，在热激后未检测到斑马鱼有不良影响。这些结果表明，斑马鱼可以耐受长期每日热激处理，突出了CRISPR-Q系统长期应用的潜力。
通过RT-qPCR评估基因表达变化，诱导CasRx导致幼鱼中smn1、tardbp、tardbpl、gpx4a和gpx4b的表达水平显著降低。在成年鱼的组织中也观察到smn1的显著降低。相反，CRISPR-Qa的激活导致幼鱼中lin28a显著上调。此外，在成年鱼中观察到sox9b的强劲诱导。这些发现表明，由热激启动子驱动的CRISPR-Q系统不仅能有效调节早期胚胎和幼鱼的基因表达，也能调节幼年和成年斑马鱼的基因表达，从而拓宽了其应用范围。
2.8 CRISPR-Q能够实现组织特异性表达的高效基因调控
组织特异性表达是转基因的关键组成部分。团队测试了CRISPR-Q系统在组织特异性环境中的效率。为此，工程构建了一个包含CRISPR-Q系统的单质粒，该系统整合了由cmlc2启动子驱动的QFvpr组织特异性表达（用于心脏表达）、Cas效应蛋白（例如5×QUAS:CasRx/dCas9vpr-2A-EGFP）和gRNA/3×sgRNA。
选择对心脏发育至关重要的心脏特异性基因myl7和myh6作为CRISPR-QKD的靶点。显微注射靶向myl7或myh6的CRISPR-QKD质粒后，选择心脏中表现出GFP表达的胚胎进行心脏形态分析和mRNA水平评估。结果显示，表达带有gMyl7或gMyh6的CRISPR-QKD的幼鱼mRNA水平与对照组相比显著降低。此外，观察到注射带有gRNA的CRISPR-QKD的幼鱼心脏变形发生率显著高于未注射gRNA的幼鱼，并且注射带有myl7靶点内突变的myl7mRNA可以挽救心脏缺陷。这些结果表明，CRISPR-QKD可以通过显微注射高效地用于瞬时的组织特异性基因调节。
接下来，团队生成了靶向tbx5a和asb5a（用于CRISPR-QKD）以及lin28a（用于CRISPR-Qa）的心脏特异性转基因斑马鱼品系。为了获得更有效的敲低，首先筛选了靶向tbx5a和asb5a的gRNA。单个gRNA显示出可变的敲低效率。然而，结合两个gRNA比每个单gRNA增加了敲低效果。这些结果强调了选择最佳靶点位置以及应用每个基因多个gRNA以提高敲低效率的重要性。
通过杂交链式反应（HCR）染色评估靶基因的组织特异性表达，观察到在表达带有gTbx5a的CRISPR-QKD的胚胎中，心脏信号显著降低，而其他组织的染色强度保持相似。同样，针对asb5a的HCR染色显示心脏特异性表达，而在表达带有gAsb5a的CRISPR-QKD的幼鱼中，这种表达几乎完全消失。
对于组织特异性CRISPR-Qa，首先使用RT-qPCR测量lin28a表达，在表达带有gLin28a的CRISPR-Qa的胚胎中观察到lin28a显著上调。随后进行lin28a的HCR染色，证实了在表达带有gLin28a的CRISPR-Qa的胚胎中心脏特异性表达显著增加。
此外，团队测试了使用急性注射方法的另一个启动子。首先筛选了六个靶向tyr（编码酪氨酸酶，为黑色素合成所需）的gRNA，这些gRNA显示出高度可变的活性。构建了一个包含ubb:QFvpr、5×QUAS:CasRx-2A-EGFP和zU6:tyrgRNA的单质粒。值得注意的是，注射携带gTyr-6或gTyr-4+6质粒的胚胎在48小时后表现出明显的色素沉着减少。这些结果表明，普遍表达的、由ubb启动子驱动的CRISPR-QKD系统可以有效诱导基因敲低。
总之，这些结果表明CRISPR-Q系统可以在转基因斑马鱼中高效实现组织特异性基因调节。
3 讨论
自CRISPR系统作为基因编辑的强大工具出现以来，已经创建了各种用于基因调控的CRISPR系统。然而，在斑马鱼中，这些系统仅用于急性注射，这限制了它们在后期阶段或在空间或时间背景下研究基因功能或模拟人类疾病的有用性。实现这一目标的一个重大挑战在于确保斑马鱼中Cas效应蛋白的一致和强表达。为了解决这个问题，采用稳健的二元表达系统至关重要。团队开发了一种称为QFvpr/QUAS的增强型二元表达系统，旨在诱导和控制转基因斑马鱼中Cas效应蛋白的稳健表达。已经成功证明，QFvpr/QUAS驱动的Cas效应蛋白CRISPR-QKD和CRISPR-Qa可用于基因调控，例如转录敲低和基因激活。这种改进的CRISPR系统为研究人员在斑马鱼中研究基因功能或模拟人类疾病提供了巨大潜力。
斑马鱼胚胎发育早期CasRx的表达可能对胚胎有害。虽然CasRx和gRNA的急性注射可能不会表现出明显的毒性，但这可能归因于CasRx蛋白/mRNA和gRNA的降解。团队偶尔在表达高水平CasRx的转基因斑马鱼中观察到毒性。这可能是由于CasRx的附带活性，尽管在实验中未检测到。值得注意的是，最近的研究表明，CasRx可能会在转基因小鼠中因附带活性导致意外基因损伤而产生毒性和致死性。高保真Cas13变体hfCas13d和hfCas13X的工程化已显示出无可辨别的附带效应，从而在小鼠中没有毒性或致死性。鉴于这些进展，评估这些高保真Cas13变体在斑马鱼转基因系统中的有效性将非常有意义。
关于转录敲低，观察到CasRx在RNA敲低中的效率存在可变性，并且在转基因斑马鱼中似乎不如细胞实验中有效。这凸显了改进预测算法以有效识别最高效gRNA的必要性，并强调了测试多个gRNA以确保预期结果的重要性。团队还强烈建议每个基因使用两到三个gRNA以确保高效敲低。事实上，先前采用急性CasRx介导敲低的研究一直使用每个基因三个gRNA。
在瞬时Cas13d递送系统中，gRNA剂量与敲低效率之间的关系可能受时间动态和饱和效应的影响。在注射后的早期时间点，Cas13d和gRNA可能接近功能饱和，限制了检测线性剂量-反应关系的能力。在后期阶段，随着gRNA和Cas13d蛋白或mRNA的降解，gRNA剂量的差异可能变得更加明显。总体而言，这些考虑因素突出了在瞬时敲低实验中解释gRNA剂量-反应关系的复杂性。
在开发QFvpr/QUAS二元表达系统的过程中，团队最初选择了两个独立的组件，但随后遇到了一些挑战。首先，生成2Tg斑马鱼耗时且需要与zU6-gRNA转基因斑马鱼品系进行后续杂交。其次，由于每个转基因拷贝数的可变性，2Tg或3Tg斑马鱼品系的表达水平可能差异很大。基于这些观察，团队推荐采用将QFvpr和5×QUAS-Cas效应蛋白组合成单个Tol2质粒的单质粒二元系统。此外，将zU6-gRNA整合到单质粒二元系统中，允许将一个包含所有三个组件的质粒注射到斑马鱼胚胎中。这种简化的方法不仅节省时间，而且有可能产生更可靠的结果。
团队还发现，转基因鱼的平均敲低效率通常低于瞬时注射达到的效率。尽管如此，尽管smn1和tardbp的敲低效率相对较低（约30%–40%），但这些水平足以诱导轻微但可检测的表型，这可能有利于研究具有严重表型或早期致死性的基因或疾病模型。然而，这种敲低水平可能不足以引发其他基因的明显表型。为了提高转基因鱼的敲低效率，团队提出了几种策略，包括筛选最有效的gRNA、结合多个最佳gRNA以及增加CasRx表达水平。在本研究中，使用了五次重复的QUAS元件，因为它提供了与瞬时实验中14×UAS相当的激活水平。鉴于QUAS比UAS更能抵抗基因沉默，增加QUAS重复次数（例如10×或15×）很可能进一步增强Cas效应蛋白的反式激活。此外，当前的构建体并未针对斑马鱼进行密码子优化。CRISPR-Q系统（尤其是CRISPR-Qa）的表达水平有时可能不理想。对CRISPR-Q组件（尤其是Cas效应蛋白）进行密码子优化可能会进一步提高斑马鱼中的表达效率。
关于CRISPRa，当前版本的CRISPR-Qa为每个靶基因使用了三个zU6驱动的sgRNA。通常，使用CRI
