SFPQ 通过稳定 RAD51 及其同源物 mRNA 来促进同源重组

本研究通过分析重组体数据，发现RNA结合蛋白SFPQ通过稳定RAD51家族mRNA间接促进同源重组修复，而非直接结合DNA双链断裂处，揭示了RNA调控在DNA修复中的新机制。

　　

Sofia Gotthold | Keile R. Hansen | Andrew N. Brown | Soham P. Chowdhury | Christine M. Joyce | Viraj Vinish | Sofie I. Rodriguez | Sambhav Jain | Hannah I. Ghasemi | Amanda C. Yoon | Julien Bacal | Meghan A. Morrissey | Brooke M. Gardner | Chris D. Richardson

加州大学圣塔芭芭拉分校定量生物科学跨学科项目，美国加利福尼亚州93106

摘要

双链断裂（DSB）的修复通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来完成。为了识别影响DSB修复结果的非典型因素，我们分析了来自联合遗传筛选的数据。通过这种方法，我们发现了剪接因子SFPQ，该因子此前已被报道与DSB相关并促进修复。在这里，我们展示了SFPQ的缺失会通过HR改变DSB的修复过程。然而，与其他已发表的研究结果不同，我们发现SFPQ并不定位在DSB处，而是独立于p53激活或DNA损伤的情况下稳定RAD51及其同源物的表达。我们的发现表明，SFPQ通过维持RAD51同源物mRNA的稳定性来促进DSB的修复，而不是通过与DSB或RAD51蛋白的直接相互作用。最终，我们的结果强调了RNA结合蛋白影响基因组稳定性的间接机制。

引言

细胞保持基因组完整性的能力对细胞稳态至关重要。未能正确修复DNA损伤可能导致染色体不稳定、突变、细胞死亡或异常生长。其中，最有害的DNA损伤形式之一是双链断裂（DSB），它们既可能由外源性因素（如电离辐射）引起，也可能由内源性过程（如转录、复制压力和氧化代谢）引起。由于未修复或修复不当的DSB可能导致疾病或死亡，细胞进化出了强大的DSB修复机制，这些机制主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）修复途径。DSB修复途径的选择受到严格调控：在DSB发生时，修复会定向为NHEJ或HR之一。NHEJ通过将DNA分子的两端连接起来来修复DSB，这可能导致序列的插入或删除，或者染色体的易位。这种修复过程主要发生在细胞周期的G1期。相比之下，HR使用姐妹染色单体或外源同源DNA分子作为模板来精确恢复断裂的DNA序列，因此HR主要发生在S期或G2期后期。 这两条途径之间的关键决策点可能受到5′端DSB切除的影响，这种切除允许RAD51加载到由切除暴露的单链DNA（ssDNA）上。这些过程将DSB处的双链DNA（dsDNA）转化为ssDNA核蛋白丝，从而促进HR过程中的同源性搜索和链入侵。NHEJ和HR的核心事件已在体外得到充分研究。然而，对DSB修复所需因子的筛选可以发现一些在这些过程中没有已知催化作用的因子。其中一些未表征的因子可能在DSB修复中发挥重要作用。例如，RAD51的同源物RAD51B、RAD51C、RAD51D、XRCC2和XRCC3有助于RAD51丝的组装和稳定。编码RAD51B、RAD51C和RAD51D的基因突变与卵巢癌、前列腺癌和乳腺癌有关。 在这项研究中，我们发现多功能RNA结合蛋白SFPQ（也称为PSF）是HR修复的调节因子。SFPQ参与多种RNA代谢过程，包括剪接、转录调控、R-loop解析和RNA运输。SFPQ是paraspeckles的关键组成部分，paraspeckles是调节病毒感染、癌症、发育和神经退行性病变中应激反应的亚核凝聚体。重要的是，SFPQ的功能障碍与多种癌症（包括卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌）以及神经退行性疾病（如ALS和额颞叶痴呆）有关。此前已有研究报道SFPQ通过与RAD51蛋白的相互作用以及在激光微照射诱导的DNA损伤区域的共定位参与DSB修复。此外，生化研究表明SFPQ在HR过程中参与链入侵，通过体外实验证明了SFPQ与RAD51的直接结合以及RAD51链交换活性的调节。我们的研究发现，SFPQ的缺失显著损害了重组能力，这一效应与RAD51缺失的效果相似。尽管其他研究也有类似报道，但我们观察到SFPQ并不定位在DSB处，而是降低了RAD51及其同源物的表达。此外，这种效应独立于p53激活，并不需要DNA损伤的诱导。总体而言，我们认为SFPQ通过结合并稳定RAD51家族mRNA来间接促进HR。我们的发现强调了转录后调控在DSB修复中的重要性，并揭示了SFPQ在维持基因组完整性方面之前未被认识到的作用。

SFPQ缺失影响基因编辑结果

我们重新分析了来自联合CRISPRi筛选的数据，以识别调控HR的因素。在以ssDNA或dsDNA为模板的筛选中，SFPQ在遗传上是HR所必需的。此外，在一项旨在识别能在Cas9诱导的DSB中存活的基因的筛选中，SFPQ是主要候选因子（见图1A和1B）。先前的研究表明SFPQ定位在DSB损伤部位并促进HR，尽管其具体机制尚不清楚。为了进一步验证这一点……

讨论

在这项研究中，我们确定RNA结合蛋白SFPQ是通过一种不以SFPQ直接定位在DSB上的机制来调控HR的关键因子。在多种实验中，SFPQ的缺失降低了RAD51蛋白水平，其影响程度与RAD51缺失相当（见图S2C），这支持了SFPQ通过维持RAD51同源物的表达来促进重组的模型。这些发现进一步证明了RNA结合蛋白（RBP）在DNA修复中的重要作用。

细胞系和培养

DIvA AsiSI-ER-U2OS细胞（雌性；由法国图卢兹综合生物学中心的Ga?lle Legube实验室提供）在含有10%胎牛血清（FBS；R&D Systems，Cat#S11550）和1%青霉素-链霉素（P/S；Gibco，Cat#15140122）的DMEM GlutaMAX培养基中培养。K-562细胞（雌性；ATCC）在含有10% FBS和1% P/S的RPMI 1640培养基（Gibco，Cat#72400120）中培养。U2OS DR-GFP细胞（雌性；由美国加州Duarte的Jeremy Stark实验室提供）……

资金来源

C.D. Richardson感谢美国国家科学基金会（CAREER MCB2443118）和美国国家普通医学科学研究所（GM142975）的资助。B.M. Gardner感谢美国国立卫生研究院（K99/R00GM121880、R35GM146784）和Searle学者计划的支持。M.A. Morrissey感谢美国国家普通医学科学研究所（GM146935）的资助。S. Gotthold感谢Andy和Mary Weinberg的资助。

CRediT作者贡献声明

Sofia Gotthold：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。 Keile R. Hansen：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验设计、概念构建。 Andrew N. Brown：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验设计、概念构建。 Soham P. Chowdhury：撰写 – 审稿与编辑、实验设计、数据分析、概念构建。 Christine M. Joyce：撰写 – 审稿与编辑……

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢法国图卢兹综合生物学中心的Ga?lle Legube提供DIvA AsiSI-ER-U2OS细胞，以及美国加州Duarte的Jeremy Stark提供U2OS DR-GFP细胞。我们还要感谢Gardner和Richardson实验室成员对这项工作的宝贵反馈。同时，我们也感谢Jennifer Smith博士慷慨提供显微镜资源，这对我们的研究至关重要。