基于分子网络的法鲁拉·图内塔纳（Ferula tunetana）花中稀有对香豆酰黄酮苷的鉴定：生物活性研究、密度泛函理论（DFT）计算、分子对接及药物相似性评估

本研究系统调查了突尼斯特有植物 Ferula tunetana 花的化学成分及生物活性。通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提物四步萃取，结合高分辨液相色谱-质谱联用分子网络分析，成功分离鉴定出两种黄酮苷类化合物及四种罕见的p-香豆酰酯衍生物。结构经NMR和HPLC验证，并评估了其抑制酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶、α-淀粉酶及细胞毒性活性。

　　

作者：Wiem Baccari、Ilyes Saidi、Omar S. Ahmed、Josep Valls、Mansour Znati、Pierre Waffo-Teguo、Hichem Ben Jannet

摩纳斯特大学，摩纳斯特科学学院，杂环化学、天然产物与反应性实验室（LR11ES39），药物化学与天然产物研究小组，环境大道5019号，突尼斯

摘要

Ferula属（伞形科）的多个物种在传统医学中被广泛使用，并表现出多种生物活性。本研究旨在探讨突尼斯特有物种Ferula tunetana Pomel ex Batt.的花朵的植物化学成分和生物活性。研究人员制备了四种提取物：石油醚、乙酸乙酯（EtOAc）、n-丁醇和剩余的水相，並对其进行了抗酪氨酸酶、抗胆碱酯酶、抗α-淀粉酶及细胞毒性活性测试。其中，乙酸乙酯提取物显示出最高的抗酪氨酸酶活性（IP = 74.2 ± 1.8%）、抗胆碱酯酶活性（IP = 84.9 ± 0.7%）和抗α-淀粉酶活性（IP = 89.6 ± 0.7%），同时对HeLa（IP = 70.2 ± 1.2%）和A549（IP = 82.2 ± 0.3%）细胞系具有显著的细胞毒性。

高分辨率LC–MS/MS分子网络分析显示，乙酸乙酯提取物富含酚类和黄酮类衍生物，这为其后续的植物化学研究提供了依据。对该提取物进行色谱纯化后，分离出了两种黄酮苷：山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷和槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷，以及四种稀有的

-香豆酰酯衍生物。这些化合物的结构通过1D和2D核磁共振光谱得以确定。

分离出的化合物被评估了其抗酪氨酸酶、抗胆碱酯酶、抗α-淀粉酶及细胞毒性活性。其中最活跃的分子通过分子对接技术进一步研究了其与酪氨酸酶、丁酰胆碱酯酶、α-淀粉酶和DNA拓扑异构酶IIα的相互作用。此外，还进行了密度泛函理论（DFT）计算和药物相似性预测，以揭示其结构-活性关系。

引言

黄酮类是一类最大且最多样化的多酚类次级代谢物，在整个植物界中普遍存在[[1], [2], [3]]。其名称来源于拉丁语flavus，意为“黄色”，反映了它们在赋予花朵、果实和叶子颜色的作用[4]。从结构上看，黄酮类基于一个由15个碳原子组成的2-苯基苯并吡喃骨架（C₆-C₃-C₆），并根据中央吡喃环的变化（如氧化状态和C3、C4位置的取代基）进一步分类[5,6]。它们的结构多样性源于羟基化和与糖的结合，形成了O-, C-, N-, 或 S-糖苷[7]。

在植物中，黄酮类作为紫外线防护剂、色素、酶调节剂和抗氧化剂发挥着关键作用。它们还通过参与毒素的生物合成和抵御病原体来增强植物的防御机制[8,9]。在人类和动物体内，黄酮类展现出广泛的生物活性。其抗氧化特性为治疗与氧化应激相关的疾病提供了潜在的疗效[10,11]。氧化应激的增加会通过损害蛋白质、脂质和核酸而对人类健康产生负面影响，导致多种不良健康后果。研究表明，黄酮类与超过五十种疾病有关，包括代谢紊乱（糖尿病和肥胖症）、癌症、神经退行性疾病、皮肤问题、高血压和心血管疾病[12]。黄酮类具有抗糖尿病、细胞毒性、抗菌、抗炎和心脏保护作用，最新研究还发现其具有抗癌活性（通过抑制肿瘤细胞增殖），以及抗腹泻和抗过敏作用[[13], [14], [15]]。

Ferula属是伞形科中第三大的属，包含约185个物种，分布于西中亚至北非地区[16]。对各种Ferula物种的植物化学研究揭示了丰富的次级代谢物，包括单萜类、倍半萜类、倍半萜香豆素、黄酮类和酚酸[[17], [18], [19], [20]]。传统上，这些物种因其抗病毒、抗菌、抗痉挛和降血糖特性而受到重视，被用于治疗哮喘、腹泻、腹痛、便秘和癌症等疾病。许多这些生物效应归因于多酚类成分，尤其是黄酮类[[21], [22], [23]]，这突显了进一步进行植物化学研究的必要性。

在突尼斯，已报道了四种Ferula物种：F. lutea (Poir.) Maire、F. tingitana L.、F. communis L. 和 F. tunetana Pomel ex Batt>。其中F. tunetana为突尼斯特有物种[24]，但在植物化学方面尚未得到充分研究。以往对F. tunetana的研究主要集中在根部，从中分离出一种新的倍半萜酯（tunetanin A）、一种新的倍半萜香豆素（tunetacoumarin A）以及几种已知化合物[25]。种子和叶片提取物的多酚含量通过HPLC-MS/MS进行了分析[26]，而花朵的研究仅限于精油中的挥发性化合物[27]。

为填补这一知识空白，本研究对F. tunetana的花朵进行了全面的植物化学分析。制备了三种提取物：乙酸乙酯、n-丁醇和剩余的水相，并对其生物活性进行了测试。采用高分辨率LC–MS/MS分子网络分析技术，识别出富含酚类和黄酮类代谢物的提取物，为后续纯化提供了依据。乙酸乙酯提取物的色谱分离成功分离出了山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和四种稀有的

-香豆酰酯衍生物。这些化合物经过结构鉴定和生物活性评估，并通过分子对接和DFT计算进一步研究，以支持体外实验结果。

基于NMR的结构表征

化合物1–6的¹H（600 MHz）和¹³C（通过HSQC和HMBC光谱推导）NMR光谱（150 MHz）使用Bruker AVANCE III光谱仪记录。溶剂为丙酮-d₆、乙腈-d₃和二甲基亚砜-d₆，未标记的溶剂作为内标。耦合常数以赫兹（Hz）表示，化学位移以百万分之一（ppm）表示。

制备型HPLC条件

制备型HPLC是在RP18制备柱（Kinetex 150 × 21.2 mm，粒径5微米）上进行的

Ferula tunetana Pomel ex Batt>花提取物的分子网络分析

为了分析Ferula tunetana Pomel ex Batt.（伞形科）花朵的化学多样性，分别用乙酸乙酯（EtOAc）、n-丁醇（BuOH）和剩余水相（AQ）进行顺序提取后，获得了三种极性提取物，并通过LC-MS/MS进行分析，并使用基于特征的分子网络（FBMN, GNPS）进行处理。由于石油醚提取物主要含有在ESI中电离效果较差的非极性脂质，因此故意将其排除在外

结论

本研究通过对突尼斯特有物种F. tunetana的花朵提取物进行了植物化学分析，采用了高分辨率LC–MS/MS分子网络技术。在所研究的提取物中，乙酸乙酯提取物含有最丰富的黄酮类衍生物，因此被选为色谱纯化的对象。通过综合分子网络方法，首次实现了对该物种黄酮类成分的靶向分离，得到了两种黄酮苷：

作者贡献

Wiem Baccari：概念构思、研究设计、方法学制定、初稿撰写。 Ilyes Saidi：软件应用、数据审查与初稿撰写。 Omar Ahmed：研究设计、方法学制定、撰写、数据审查与编辑。 Josep Valls：方法学制定与验证。 Mansour Znati：数据可视化与验证。 Pierre Waffo-Teguo：研究指导、方法学制定与验证。 Hichem Ben Jannet：概念构思、研究指导、数据审查与验证。

利益冲突

作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本研究结果的个人关系。

CRediT作者贡献声明

Wiem Baccari：初稿撰写、方法学制定、研究设计。 Ilyes Saidi：初稿撰写、软件应用。 Omar S. Ahmed：撰写、数据审查与编辑、方法学制定。 Josep Valls：验证、方法学制定。 Mansour Znati：数据可视化与验证。 Pierre Waffo-Teguo：验证、研究指导、方法学制定。 Hichem Ben Jannet：撰写、数据审查与编辑、验证、研究指导。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本研究结果的个人关系。

致谢

波尔多代谢组学设施和MetaboHUB（ANR11-INBS-0010）项目为我们的LC-MS分析提供了支持。