《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Ketogenic diet modulates AMPK-mTOR pathway in breast cancer
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乳腺癌的生酮饮食通过激活AMPK/mTOR通路抑制肿瘤生长。研究发现，KD在4T1小鼠模型中使肿瘤体积减少50.73%，同时细胞水平显示葡萄糖限制上调ROS并激活AMPK，抑制mTOR活性。研究揭示了KD通过ROS介导的AMPK/mTOR信号通路抑制肿瘤的机制，为代谢干预治疗提供新证据。
罗雅欣|李俊俊|杨宇欣|严蕾|黄子扬|陈丽霞|赵莉莉|王静|杨永明|刘先平|杨希华
山西医科大学附属肿瘤医院，030013，太原，山西，中国
摘要
乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。这种疾病受多种复杂因素的影响，具有较高的死亡率，对女性的生命和健康构成严重威胁。生酮饮食（KD）是一种高脂肪、低碳水化合物的饮食方案，已被视为乳腺癌的潜在辅助治疗策略；然而，其在调节肿瘤代谢中的具体机制尚未完全阐明。在本研究中，我们深入探讨了KD在乳腺癌背景下的作用机制。在携带4T1乳腺肿瘤的小鼠中，KD使肿瘤生长抑制了50.73%（P<0.01），并激活了AMPK-mTOR通路，表现为AMPK磷酸化水平增加了2.1倍，mTOR活性降低。在细胞水平上，葡萄糖限制通过增加4T1细胞内的活性氧（ROS）和激活AMPK来调节mTOR的表达。结合动物和细胞实验的结果，KD可能通过限制葡萄糖摄取来改变细胞内ROS的水平，从而调节AMPK-mTOR通路的表达，最终抑制肿瘤生长。总体而言，我们的结果表明KD通过ROS介导的AMPK/mTOR信号通路发挥抗肿瘤作用，支持其作为乳腺癌代谢干预策略的潜力。
引言
乳腺癌（BC）是女性中最常见的癌症1。更具侵袭性的三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2的表达，其5年生存率仅为12%2。TNBC是女性中常见的乳腺癌类型。化疗是肿瘤科临床中最常用的治疗手段之一3。尽管外科手术、化疗、靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但由于现有治疗方案的副作用严重且耐受性差，许多乳腺癌患者的预后仍然不佳4。国内外研究人员正在探索乳腺癌的术后治疗策略，以改善患者的生活质量。
流行病学证据表明，饮食不仅影响癌症风险，还对治疗结果产生显著影响5。最著名的是，Warburg在1923年首次描述了碳水化合物与癌症之间的关联，他发现肿瘤细胞的葡萄糖消耗显著增加6,7。这种现象被称为Warburg效应。近年来，低葡萄糖生酮饮食（KD）也被证明可以逆转促进肿瘤恶性的氧化还原信号通路8,9；当作为胶质瘤的辅助治疗时，它可以改变转基因表达模式并降低活性氧（ROS）水平10。Hopkins等人11还证明，联合使用KD可以改善携带各种PI3K驱动肿瘤的小鼠的生存率。在大多数临床前肿瘤模型中，KD已被证明可以抑制糖酵解和癌细胞增殖12。鉴于癌细胞表现出异常的葡萄糖代谢，导致肿瘤中的葡萄糖摄取量高于邻近正常组织13，KD可能作为一种基于饮食的术后辅助治疗策略用于癌症治疗。
葡萄糖饥饿是肿瘤细胞中的主要代谢应激形式之一14。葡萄糖剥夺会损害糖酵解和戊糖磷酸途径14，并增加ROS的产生，从而引发氧化应激和随后的细胞死亡。ROS是一组在正常有氧代谢过程中产生的多种分子氧衍生物15。在葡萄糖限制条件下，ROS被视为AMPK的正向调节因子15。细胞能量状态的降低以及ADP/ATP和AMP/ATP比值的升高会激活AMP激活的蛋白激酶（AMPK）16——这是细胞代谢稳态的关键调节因子17,18。AMPK还能够抑制mTOR通路19,20，尤其是在能量不足的情况下。尽管先前的研究表明KD或葡萄糖限制可以调节ROS水平并激活多种类型的癌细胞（包括TNBC）中的AMPK21，但KD诱导的ROS生成与4T1乳腺肿瘤中的AMPK–mTOR信号通路之间的精确分子相互作用尚未直接阐明。
多项临床前和临床研究强调了KD作为癌症治疗辅助策略的潜力22。通过诱导酮症状态，这种饮食方案为癌细胞创造了不利的代谢微环境，可能阻碍其生长和增殖；然而，其在4T1乳腺癌中的作用机制仍不清楚。在本研究中，我们探讨了KD是否通过ROS-AMPK-mTOR通路在体内对4T1肿瘤小鼠产生肿瘤抑制作用，以及葡萄糖限制是否通过ROS-AMPK通路在体外调节4T1细胞中的mTOR表达。值得注意的是，我们的研究提示KD诱导的ROS积累、AMPK激活和mTOR抑制之间存在潜在联系，补充了以往仅关注代谢应激或AMPK激活在肿瘤抑制中的研究。
细胞培养和葡萄糖限制条件
4T1细胞系是一种在BALB/C小鼠中表现出生长和转移的TNBC细胞系，可作为IV期人类乳腺癌的动物模型。4T1细胞由张瑞萍教授（山西省人民医院）提供，培养于RPMI-1640培养基（Procell Life Technologies Ltd., 武汉，中国；目录号PM150110）中，添加了10%的胎牛血清（FBS；Gibco Life Technologies, 纽约，美国；目录号A5256701）和1%的青霉素-链霉素溶液（Procell；目录号P1400）。
生酮饮食对小鼠基础生理指标和肿瘤生长的影响
为了评估生酮饮食对小鼠的影响，我们在实验过程中系统地监测和分析了几个关键生理指标。持续跟踪并记录了KD组和模型组小鼠的体重，两组表现出一致的体重变化趋势（图1E）。在任何时间点，两组之间的体重均无显著差异。
血液酮体水平是反映KD干预效果的关键指标。
讨论
乳腺癌是一种多因素引起的复杂恶性肿瘤，在全球女性恶性肿瘤发病率中长期居首位27。其高死亡率对公共卫生和临床肿瘤学构成了严重挑战27，因此开发有效的治疗策略成为医学研究的优先事项。近年来，随着基于代谢调节的治疗方法的深入探索，生酮饮食因其潜在的治疗价值而受到了广泛关注
资助
本研究得到了山西省中医药重点实验室建设项目（#zyyyyjs2024018）和山西省科技创新人才团队专项项目（#202204051001033）的支持。
作者贡献
所有作者都参与了研究的构思和设计。X. Y.：概念构思、方法学和审稿。X. L.：概念构思和方法学。Y. L.：数据管理和数据收集。J. L.：实验操作和数据收集
CRediT作者贡献声明
罗雅欣：撰写——初稿、实验、数据管理。李俊俊：撰写——初稿、实验、数据管理。杨宇欣：实验、数据管理。严蕾：实验、数据管理。黄子扬：实验、数据管理。陈丽霞：数据管理。赵莉莉：数据管理。王静：数据管理。杨永明：监督。刘先平：方法学、概念构思。杨希华：方法学、资金获取、概念构思。利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文报告工作的财务利益或个人关系。本研究得到了山西省中医药重点实验室建设项目（#zyyyyjs2024018）和山西省科技创新人才团队专项项目（#202204051001033）的支持。
