《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Probing the influence of low-level laser therapy on cellular and standard proteins by light emitting diode -induced autofluorescence spectroscopy
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本研究探讨了光生物调控(PBM)中直接蛋白-光子相互作用对光学响应的影响。研究人员通过LED诱导自荧光光谱技术，评估了632.8 nm和830 nm激光对人血清白蛋白(HSA)、纤维蛋白原及SH-SY5Y细胞蛋白本征荧光的波长与剂量依赖性调控。结果表明，PBM波长可直接、特异地影响蛋白光物理性质，而细胞环境则塑造了其功能性结果，为理解PBM的分子机制提供了蛋白质层面的实验证据。
在现代医学和生物技术的交叉领域，一种名为“光生物调控”(Photobiomodulation, PBM)或“低功率激光疗法”(Low-Level Laser Therapy, LLLT)的技术正悄然兴起。想象一下，用一束柔和的、非热性的红光或近红外光照射细胞或组织，就能像一把“光钥匙”一样，开启一系列促进修复、减轻炎症甚至保护神经的生物学过程。自1967年Endre Mester博士偶然发现低功率激光能加速小鼠伤口愈合和毛发再生以来，PBM已在临床和组织工程中展现出广阔的应用前景。其核心作用机制被认为是光被细胞内的“光感受器”（尤其是线粒体中的细胞色素c氧化酶 (cytochrome c oxidase, CCO)）吸收后，触发复杂的信号级联反应，最终改善细胞能量代谢和功能。
然而，一个根本性的科学问题长期悬而未决：我们所观察到的PBM效应，是完全依赖于这些复杂的细胞信号通路，还是激光本身就能直接与生命的基本构件——蛋白质——发生相互作用？蛋白质并非只是被动的“背景板”，其结构中含有色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸，它们能发出天然荧光（即本征荧光），且对周围环境的微小变化极其敏感。这种直接的光-蛋白相互作用是否构成了PBM光学响应的基础组成部分？这一问题对于从分子层面完整理解PBM机制至关重要，但此前缺乏系统的研究。
为此，来自印度曼尼帕尔高等教育学院生命科学学院的研究团队Shanmuka Sreeya Devarakonda、Shaik Basha、K. Ameera、Anshuman Mishra、Subhash Chandra和Krishna Kishore Mahato在《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》上发表了一项深入研究。他们旨在超越传统的细胞功能测定，直接探究PBM相关波长（632.8 nm可见红光和830 nm近红外光）是否能在没有细胞光感受器参与的情况下，调控蛋白质本身的本征荧光。这项研究试图回答：PBM是否能够直接影响蛋白质的物理状态？这种直接效应在不同蛋白质之间有何差异？以及在复杂的细胞环境中，蛋白质的响应又是如何被塑造的？
为了回答这些问题，研究人员采用了几个关键的技术方法组合。首先，他们建立了精确的激光照射系统，使用波长632.8 nm的氦氖(He-Ne)激光和830 nm的半导体二极管激光，在严格控制功率密度(8.49 mW/cm2)、光斑面积和照射时间的条件下，对样品进行剂量梯度照射。研究设计了两个平行的实验体系：一是使用纯化的标准蛋白（人血清白蛋白 (Human Serum Albumin, HSA) 和牛纤维蛋白原）；二是使用人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系，在生理相关剂量下照射后提取总蛋白。核心技术在于LED诱导的自荧光光谱技术 (light-emitting diode–induced autofluorescence spectroscopy, LED-IAF)。该技术利用285 nm的深紫外LED激发样品中蛋白质天然荧光团（主要是色氨酸和酪氨酸），通过光谱仪采集300-600 nm的发射光谱，从而无需任何化学标记即可非侵入性地探测蛋白质构象的细微变化。对于细胞样本，研究人员在激光照射后，先进行蛋白质提取和定量，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) 分离蛋白质，接着对整个凝胶进行空间扫描式的LED-IAF光谱记录，生成荧光“指纹”图谱。最后，利用MATLAB软件对获得的大量光谱数据进行处理和可视化，生成二维热图，直观比较不同处理条件下蛋白质荧光强度和分布的变化。
研究结果部分清晰地展示了在不同体系中的发现：
3.1. PBM处理后人血清白蛋白的自荧光光谱
研究显示，无论是632.8 nm还是830 nm激光照射纯化的HSA，其自荧光光谱的形状和峰位均未发生可检测的变化，这表明照射没有导致蛋白质发生明显的构象变性或二级结构破坏。然而，荧光强度却发生了剂量依赖性的双相变化：在较低剂量照射下，HSA的自荧光强度有轻微增强；而在较高剂量下，荧光强度则逐渐衰减。这种变化被归因于激光引起的蛋白质三级结构细微松弛（低剂量时增加荧光团溶剂可及性）或荧光淬灭效应（高剂量时）。
3.2. PBM处理后纤维蛋白原的自荧光光谱
与HSA不同，纤维蛋白原在632.8 nm激光照射下，所有剂量的自荧光强度均显著降低（发生淬灭），并未显示出明显的双相响应。在830 nm近红外光照射下，纤维蛋白原则表现出部分双相趋势，即低剂量时荧光轻微增强，高剂量时减弱。重要的是，尽管强度变化显著，纤维蛋白原的光谱同样未发生位移，说明其局部荧光团微环境得以保持，变化主要源于辐射效率的改变而非构象展开。
3.3. 632.8 nm激光对SH-SY5Y细胞系的影响
对SH-SY5Y细胞进行632.8 nm激光照射并提取蛋白质进行分析后发现，SDS-PAGE染色显示蛋白质条带模式基本保留，但总染色强度随剂量增加呈渐进性下降。自荧光热图分析则揭示了更为复杂的变化：细胞蛋白质的自荧光强度总体上随着照射剂量的增加而单调下降。此外，细胞蛋白质的荧光发射峰出现了剂量依赖性的“红移”（向更长波长方向移动），这与纯化蛋白中观察到的光谱峰位稳定形成鲜明对比，暗示了细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用和分子拥挤环境对荧光团微环境产生了影响。
3.4. 近红外830 nm激光对SH-SY5Y细胞系的影响
830 nm激光照射SH-SY5Y细胞后的结果与632.8 nm有所不同。SDS-PAGE染色强度在不同剂量间保持相对均匀，甚至在1 J/cm2剂量下有轻微增加。自荧光分析显示，1 J/cm2和5 J/cm2照射组的荧光强度高于未照射对照组，而10 J/cm2和15 J/cm2组则荧光降低。这表明近红外光的效应具有更复杂的剂量依赖性，且细胞蛋白质的响应模式再次与纯化蛋白体系不同。
在讨论与结论部分，研究者对以上发现进行了综合阐释。本研究首次通过实验证明，常用于PBM的红色与近红外光波长能够直接调控纯化蛋白质体系的本征荧光，且这一过程独立于任何细胞光感受器或代谢途径。HSA表现出的双相荧光响应（先增强后减弱）与细胞PBM研究中报告的“毒物兴奋效应” (hormesis) 趋势在形式上类似，但其分子基础截然不同：在纯化蛋白中，这纯粹源于直接的蛋白-光子光物理相互作用，如荧光团微环境的微小调整或非辐射能量耗散。而纤维蛋白原以淬灭为主的响应模式，则凸显了蛋白质拓扑结构（如紧凑球状的HSA vs. 延伸多结构域的纤维蛋白原）在决定光-蛋白相互作用敏感性中的关键作用。
最关键的发现在于纯化蛋白与细胞提取蛋白响应的本质区别。尽管细胞蛋白质的SDS-PAGE条带模式得以保留，但其自荧光响应（如单调下降、发射峰红移）与纯化蛋白截然不同。这强有力地表明，细胞水平的组织架构——包括分子拥挤、蛋白质-蛋白质相互作用、异质性的微环境以及可能存在的翻译后修饰——对PBM响应施加了额外的约束并进行了重塑。因此，虽然直接的光-蛋白相互作用可能构成了PBM中观测到的基线光学变化的组成部分，但它并不足以完全解释在活体细胞系统中观察到的复杂功能性结果。后者是直接光物理效应与细胞信号网络、代谢反馈和动态蛋白质组装共同作用的产物。
这项研究的意义在于，它将PBM机制的研究视角从传统的线粒体信号通路，拓展到了更基础的生物大分子物理化学层面。它证实了蛋白质本身可以作为PBM的一个直接作用靶点，其响应具有蛋白质特异性和波长依赖性。这为理解PBM提供了新的分子维度，并提示在设计和优化PBM治疗方案时，需要考虑目标组织或细胞中特定蛋白质组的组成和状态。同时，研究建立的非标记、无损的LED-IAF光谱结合SDS-PAGE的技术策略，为在蛋白质组学尺度上实时、原位监测PBM引起的细微构象变化提供了强有力的工具。尽管研究存在一些局限性，如纯化蛋白与细胞体系的照射剂量不完全对等、主要依赖荧光光谱单一读数等，但它无疑为未来整合更多结构生物学技术、在更复杂的生理病理模型中进行多尺度研究铺平了道路，最终将推动PBM从一种经验性疗法向机制明确、精准可控的生物医学工具迈进。
