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动脉粥样硬化主要由oxLDL在动脉壁积累引发，其中7KC作为主要氧化 sterol 可诱导血管细胞凋亡和自噬障碍。本研究证实，富集磷脂酰丝氨酸（BMP）能通过维持线粒体完整、抑制caspase激活及恢复自噬流（LC3-II/p62比值正常化）等多途径协同抑制7KC诱导的细胞损伤，并验证了相关自噬调控基因（Sqstm1/Becn1/Pink1）的表达调控。
雷米·朗贝尔（Remi Lambert）|谢琳·蒙蒂莱（Sherine Montillet）|克拉拉·埃诺（Clara Hennot）|阿加特·迪亚兹-冈萨雷斯（Agathe Diaz-Gonzalez）|玛丽昂·吉沙尔（Marion Guichard）|埃梅琳·克罗斯-佩里亚尔（Emeline Cros-Perrial）|拉斯·佩特·约尔德海姆（Lars Petter Jordheim）|卡伦·加盖（Karen Gaget）|费德里卡·卡莱弗罗（Federica Calevro）|塞琳·卢凯恩-科斯塔兹（Celine Luquain-Costaz）|伊莎贝尔·德尔顿（Isabelle Delton）
里昂大学（Université Claude Bernard Lyon 1）、法国国家科学研究中心（CNRS）、LAGEPP UMR 5007实验室，维勒布尔讷（Villeurbanne F-69622，法国）
摘要
动脉粥样硬化是心血管疾病的主要原因之一，其发病机制与氧化低密度脂蛋白（oxLDL）在动脉壁中的积累密切相关。7-酮胆固醇（7KC）是oxLDL和动脉粥样硬化斑块中的一种主要氧化甾醇，它可引发多种细胞损伤，包括溶酶体结构破坏、氧化应激、细胞凋亡以及自噬功能障碍。双（单酰基甘油）磷酸酯（BMP，又称溶酶体双磷酸脂）是一种特异性磷脂，主要存在于内溶酶体中，能够调节囊泡运动、溶酶体酶活性、细胞内胆固醇转运及其氧化代谢过程。通过使用经过验证的小鼠RAW 264.7巨噬细胞模型，我们研究了BMP是否具有对抗7KC诱导的损伤的保护作用。研究结果表明，BMP通过维持细胞存活率、保持细胞形态和调节脂质平衡，在细胞水平上提供了全面的保护。从机制上看，BMP通过保护线粒体完整性和抑制半胱天冬酶活性来防止细胞凋亡（表现为BAX/BCL2比值正常化、pro-Caspase-3水平保持稳定以及PARP切割减少）。值得注意的是，BMP还能恢复自噬活性，从而防止LC3-II和p62的病理性积累（这是自噬功能障碍的标志）。LC3与BMP之间的增强共定位表明两者在应激反应中存在直接的功能相互作用。基因表达分析证实，BMP能够纠正关键自噬调节因子（如Sqstm1、Becn1和Pink1）的转录失调。综上所述，BMP作为一种内源性保护因子，通过协调调节细胞死亡和自噬途径，在多个层面上对抗7KC引起的细胞损伤。
引言
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征是脂质、免疫细胞和纤维成分在动脉壁内的逐渐积聚，最终导致斑块形成和血管阻塞[1][2]。该疾病是2型糖尿病、肥胖症和代谢综合征等与氧化应激和脂质代谢紊乱相关疾病的主要心血管并发症。在导致动脉粥样硬化病变的各种生化因素中，氧化低密度脂蛋白（oxLDL）起着核心作用[3][4][5]。oxLDL颗粒中的氧化甾醇是一类广泛的胆固醇氧化产物，能够调节多种生物学过程，包括胆固醇稳态、血管细胞的氧化应激和炎症反应[6][7][8]。7-酮胆固醇（7KC）是一种丰富的生物活性氧化甾醇，由胆固醇的非酶促氧化产生，存在于多种常见食物中以及oxLDL和动脉粥样硬化斑块中。研究表明，7KC可促进巨噬细胞泡沫细胞的形成、内皮细胞完整性的破坏、单核细胞的黏附和迁移，以及斑块的发展和不稳定[7][10][11]。7KC通过多种细胞机制表现出强烈的细胞毒性和促动脉粥样硬化作用，包括线粒体功能障碍、内质网应激、氧化应激生成和溶酶体损伤[12][13][14]。在血管细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞）中，7KC的暴露会引发复杂的细胞反应，涉及自噬和细胞凋亡[15][16][17]。人们提出“氧化凋亡”这一术语来描述由7KC等氧化甾醇引发的、同时涉及氧化应激、细胞凋亡级联反应和自噬过程的特殊细胞死亡形式[18][19]。自噬在动脉粥样硬化中具有矛盾的作用：在轻微氧化应激下，自噬通过清除受损线粒体和维持斑块稳定性起到保护作用[17][20]；而在严重氧化应激下，自噬功能受损，导致细胞死亡并促进斑块进展[21][22]。在巨噬细胞中，自噬还参与泡沫细胞的形成和胆固醇的释放[23][24][25]。
溶酶体在细胞脂质代谢和应对7KC诱导的应激反应中起着关键作用。特别是在高脂负荷条件下（如动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞泡沫细胞），溶酶体的完整性和功能能力尤为重要[26]。研究表明，7KC可导致溶酶体功能障碍，表现为溶酶体膜通透性增加[27][28]、cathepsin B和D活性下降[28]以及自噬过程受阻[17][22][29]。内溶酶体富含双（单酰基甘油）磷酸酯（BMP，又称溶酶体双磷酸脂LBPA）。BMP是一种具有独特结构的磷脂，其分子骨架为sn-1-甘油磷酸酯-sn-1′-甘油（sn-1:sn-1′），且含有丰富的酯化长链不饱和脂肪酸（尤其是油酸和二十二碳六烯酸）[30][31]。BMP占晚期内溶酶体和溶酶体膜总磷脂的70%左右[32][33]，在多种溶酶体功能中发挥重要调节作用。它作为多种溶酶体水解酶（如鞘磷脂酶和葡萄糖脑苷脂酶）的辅因子，增强这些酶的催化活性，促进酸性溶酶体环境中的底物代谢[34][35][36][37]。此外，BMP还影响溶酶体膜的空间结构及腔内囊泡的形成，这对膜蛋白和脂质的隔离与降解至关重要[31][33][38]。先前研究还发现BMP能调节巨噬细胞中胆固醇的转运[41][42]，并具有抗oxLDL诱导的细胞损伤作用（通过减少氧化甾醇生成和抑制细胞凋亡[43][44]。最近的研究还表明BMP参与调控自噬与细胞凋亡之间的相互作用[36][45]。
鉴于越来越多的证据表明内溶酶体中的BMP参与胆固醇稳态、细胞凋亡和自噬相关细胞功能，我们研究了BMP对7KC诱导的细胞损伤的保护作用。利用先前验证的RAW巨噬细胞BMP富集模型[42][46]，我们探讨了BMP对7KC诱导的细胞毒性的影响，分析了相关的细胞死亡机制（即细胞凋亡和自噬），并揭示了其背后的分子机制。
细胞培养材料
小鼠RAW 264.7巨噬细胞购自美国类型培养物收集中心（American Type Culture Collection）。最小必需培养基（MEM）和非必需氨基酸（NEAA）购自Sigma-Aldrich公司。胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（PS）购自Dutscher公司，支原体清除试剂nanomycopulitine购自Biowest公司。1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)钠盐（DOPG）和7-酮胆固醇（7KC）购自Avanti Polar Lipids公司。
抗体
以下是一系列一抗：
评估BMP富集对7-酮胆固醇诱导的细胞毒性的保护作用
首先通过相位对比显微镜观察细胞生长和形态（图1A）。暴露于50 μM 7-酮胆固醇（7KC）24小时的细胞表现出典型的细胞死亡特征，包括细胞数量减少、显著萎缩、碎片化以及黏附能力下降。单独使用BMP并未产生效果，但在7-酮胆固醇存在的情况下显著保持了细胞的正常生长和形态。随后对存活细胞进行了定量分析。
讨论
本研究表明，BMP富集能有效对抗RAW巨噬细胞中7-酮胆固醇引起的细胞损伤。BMP通过保护细胞免受细胞毒性、恢复脂质稳态、抑制凋亡信号通路以及调节关键自噬相关基因来防止自噬功能障碍。值得注意的是，这些保护作用在7-酮胆固醇浓度与动脉粥样硬化斑块中检测到的浓度相当[51][52]。先前的研究也证实了这一点。
研究局限性
尽管本研究为BMP对抗7-酮胆固醇诱导的细胞损伤的保护机制提供了新的见解，但仍存在一些局限性。首先，我们的研究基于小鼠RAW 264.7细胞系，该细胞系在动脉粥样硬化研究中被广泛使用，但可能无法完全反映人类巨噬细胞对氧化甾醇的反应。在原代人类巨噬细胞中进行验证将增强这些发现的临床应用价值。其次，本研究完全在体外条件下进行。
作者贡献声明
雷米·朗贝尔（Remi Lambert）：负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、验证、方法学设计、实验实施和数据分析。克拉拉·埃诺（Clara Hennot）：负责写作、审稿与编辑、验证、方法学设计、实验实施和数据分析。谢琳·蒙蒂莱（Sherine Montillet）：负责写作、审稿与编辑、验证、方法学设计、实验实施和数据分析。拉斯·佩特·约尔德海姆（Lars Petter Jordheim）：负责写作、审稿与编辑、验证、资源协调和方法学设计。埃梅琳·克罗斯-佩里亚尔（Emeline Cros-Perrial）：负责写作、审稿与编辑、验证和实验实施。
资助
本研究得到了里昂应用科学研究所（INSA Lyon，法国）、VML协会（Vaincre les Maladies Lysosomales，法国）以及法国国家农业、食品与环境研究院（INRAE，法国）的支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
作者衷心感谢INNOBIOVIR平台（里昂，法国）提供的技术支持和资源援助。
