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本研究发现沙门氏菌六型分泌系统（T6SS）的核心蛋白VgrS（VgrG）呈现出一种前所未有的开放构象。为解决T6SS效应物装载机制多样性未阐明的问题，研究人员解析了VgrS的X射线晶体结构，揭示了其独特的结构域延伸与开放构象，为理解T6SS的物种特异性适应及多重效应物装载提供了新的分子基础。该结构凸显了每种细菌的T6SS都是独特的。
细菌间的生存竞争异常激烈，为了争夺有限的资源和生存空间，它们演化出了一系列“生化武器”和“注射装置”。其中，革兰氏阴性菌普遍装备着一种名为六型分泌系统（T6SS）的复杂纳米机器。这套系统的工作原理酷似微型注射器，能在细胞接触时，将有毒的效应物蛋白注射进竞争对手或宿主细胞内，从而消灭对手或引发疾病。肠炎沙门氏菌便是依赖这套系统来定植宿主肠道并引发胃肠炎甚至系统性感染的重要人类病原体。
然而，一个关键的谜团仍然存在：细菌是如何将种类繁多的“弹药”（效应物）精准地装载到这台“注射器”的尖端（主要由VgrG蛋白构成）上的？目前已知，不同菌种甚至不同菌株的T6SS在效应物装载机制上存在巨大差异，VgrG蛋白作为通用的模块化平台，其具体的分子适应策略远未明晰。特别是对于伤寒沙门氏菌而言，其基因组中仅编码一个位于毒力岛SPI-6上的VgrG（称为VgrS），却需要装载多个不同的效应物。VgrS如何完成这一任务，其结构上有何独特之处，这些问题都亟待解答。因此，深入研究VgrS的精细结构，对于揭示沙门氏菌T6SS的独特运作方式、理解其致病机理具有至关重要的意义。
本研究的相关成果已发表于《Journal of Structural Biology》。
为了探究上述问题，研究人员主要采用了以下关键技术方法：1）基因工程与蛋白纯化：构建并表达了沙门氏菌VgrS的截短体（81-729位氨基酸）以解决全长蛋白不溶的问题，并通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。2）X射线晶体学：获得了VgrS的高质量晶体，并在加拿大光源中心收集了衍射数据，通过分子置换法（以绿脓杆菌VgrG1为模板）解析了其3.1 ?分辨率的晶体结构。3）结构分析与模型预测：使用ChimeraX等软件进行结构比对、表面性质（如静电势、保守性）分析和测量。利用AlphaFold3预测了VgrS单体、三体及其与效应物（Rhs1, Rhs2, Tlde1a）或伴侣蛋白Hcp的复合物结构。4）电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）：用于鉴定晶体结构中观察到的未知配体是否为金属离子，以阴性对照SciW和阳性对照PLpro作为参照。
研究结果
2.1. VgrS在沙门氏菌属中的遗传背景
VgrS编码于沙门氏菌毒力岛SPI-6内，该区域包含所有T6SS核心基因以及四个已知的效应物/免疫蛋白对：tae4/taiA, tlde1a/tldi1a, rhs1/rhsI1和rhs2/sciX。与其他沙门氏菌血清型的T6SS相比，SPI-6 T6SS的基因组织，尤其是效应物库，存在变异性。比较分析表明，伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的VgrS亲缘关系较近，但与鸡沙门氏菌和都柏林沙门氏菌的VgrS在序列上存在差异，后两者含有一个前者没有的gp5延伸区域。
2.2. 鼠伤寒沙门氏菌VgrS的X射线晶体结构
研究人员解析了VgrS（81-729）的晶体结构。该结构显示VgrS是一个三聚体，包含与T4噬菌体刺突蛋白同源的结构域：头部（gp27，残基122–429）、含有OB折叠的颈部（残基453–544）和刺突（gp5，残基483–548）。刺突顶部形成一个约32 ?边长的三角形平台，是装载含PAAR结构域效应物的结合位点。晶体堆积具有极高的溶剂含量（82.22%）。
2.3. VgrS头部结构域呈现开放构象
与已知的其他VgrG蛋白（如绿脓杆菌VgrG1的“开放”和“闭合”构象）相比，VgrS结构最显著的差异在于其gp27区域存在一个开放的延伸环构象。这形成了一个从一个单体延伸出来并插入相邻单体的“结构域延伸”，导致VgrS三聚体底部比VgrG1的开放或闭合构象都要宽。这种构象破坏了其他VgrG中由三个单体共同形成的连续β-桶结构。B因子分析表明该区域具有柔性。AlphaFold3预测的VgrS三聚体模型更接近于VgrG1的闭合构象，提示VgrS可能在开放与闭合构象之间转换。
2.4. VgrS的分子表面揭示效应物装载线索
对VgrS分子表面的保守性、静电势和疏水性分析发现：1）VgrS整体呈高度电负性，但在颈部OB折叠附近有保守的带正电残基斑块，这些残基在晶体结构中与硫酸根离子配位，可能参与效应物或衔接蛋白的结合。2）VgrS的C末端尾巴较短，含有多个酸性残基，并沿着刺突向下延伸，其独特性质可能用于招募沙门氏菌特异的效应物装载衔接蛋白。3）VgrS gp27头部结构域的内部空腔较大（底部约52 ?），且空腔底部带有正电，足以容纳球状蛋白，可能是另一个效应物装载位点。AlphaFold3预测效应物Rhs2可能结合在VgrS的OB折叠区域，而Tlde1a则可能通过结合已装载的Rhs1的PAAR结构域与VgrS发生间接互作。
2.5. T6SS组装中VgrS的潜在构象变化
已知与PAAR结构域和/或Hcp结合的VgrG结构均处于闭合构象。AlphaFold3预测的VgrS与Hcp2复合物模型也显示VgrS采取闭合构象，其结构域延伸区域折叠成反平行β-片层，使得gp27底部变窄，从而能与Hcp环结合。将VgrS晶体结构（开放构象）与预测的VgrS:Hcp2复合物模型对齐比较发现，结构域延伸的开放构象使底部拓宽了约10?，破坏了多个预测的VgrS-Hcp接触位点，这强有力地表明VgrS必须从开放构象变为闭合构象才能结合Hcp。与脆弱拟杆菌VgrG-PAAR-Hcp复合物结构的比较进一步支持了这一观点。
研究结论与讨论
本研究成功解析了肠炎沙门氏菌血清型鼠伤寒的T6SS核心组件VgrS的晶体结构，获得了几项重要发现和结论。
首先，VgrS结构展现了一种前所未有的“开放构象”，这主要归因于其gp27头部一个独特的“结构域延伸”。该区域的延伸环从一个单体伸出并插入相邻单体，导致三聚体底部空腔显著增大，并破坏了其他VgrG中典型的连续β-桶结构。这一构象是VgrS所独有的。
其次，结构与比较分析表明，VgrS很可能在“开放”与“闭合”构象之间动态转换。B因子分析提示结构域延伸区域具有柔性；AlphaFold3预测的VgrS模型及其与Hcp或PAAR结构域的复合物模型均呈现闭合构象；已知的VgrG-效应物-Hcp复合物结构也均为闭合构象。这些证据共同支持VgrS的构象变化可能与效应物装载和T6SS组装相耦合。一种合理的模型是：VgrS最初处于开放构象，无法结合Hcp；当效应物（如通过其PAAR结构域）装载到VgrS刺突顶端的平台或C末端区域时，可能触发构象变化，使VgrS转为闭合构象；随后，闭合构象的VgrS其gp27底部得以与Hcp环（其内部可能已装载了另一种效应物）结合，进而启动T6SS“注射器”的组装与发射。
最后，对VgrS分子表面的详细分析揭示了多个可能参与沙门氏菌特异性效应物装载的特征位点：包括OB折叠附近保守的带电残基斑块（可能与衔接蛋白发生静电相互作用）、较短的酸性C末端尾巴、以及gp27头部宽大的内部空腔。这些特征为理解单个VgrS如何装载多个不同效应物提供了结构线索。
总之，VgrS的独特结构不仅揭示了沙门氏菌T6SS在分子层面的特异性适应，也为理解VgrG蛋白如何作为通用却又高度可变的平台来调控效应物装载这一核心生物学过程提供了新的见解。该研究突出强调了不同细菌物种甚至菌株的T6SS都是独特的，它们通过VgrG等关键蛋白的细微结构变异来适应各自特定的生存需求与致病策略。
