基于GFP–PAC共表达盒的纯化系统的优化：用于高效构建和快速筛选重组HSV-1病毒

提高重组HSV-1纯化效率的GFP-PAC双选择系统研究。

　　

Mishar Kelishadi|Alijan Tabarraei|Kayhan Azadmanesh

伊朗德黑兰牧草研究所分子病毒学系

摘要

溶瘤病毒（OVs）是一类有前景的癌症治疗药物，它们被设计成能够在恶性细胞中选择性复制并裂解这些细胞，同时不损害正常组织。其中，通过靶向删除即时早期（IE）基因而生成的重组1型单纯疱疹病毒（HSV-1）已成为主要候选者，目前已有几种相关载体进入了三期临床试验阶段。通常通过使用穿梭载体进行同源重组将基因修饰引入HSV-1基因组；然而，从亲本病毒群体中分离出重组病毒仍然是一个劳动密集型且技术要求较高的过程。这一限制主要源于同源重组的效率较低，以及亲本病毒经常具有相对于重组变体的复制优势。在这项研究中，我们开发并优化了一种新的纯化方案，该方案结合了GFP–PAC共表达盒，实现了对重组病毒结构的嘌呤霉素选择和基于荧光的鉴定。这种双重选择方法显著加快并简化了重组HSV-1的分离过程，提高了效率和纯度。优化的方案为疫苗开发、基因治疗和基础病毒学研究提供了可靠且可扩展的方法。

引言

1型单纯疱疹病毒（HSV-1）是疱疹病毒科（Herpesviridae）阿尔法疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）中的一个普遍存在的成员，其基因组为线性双链DNA，长度约为152 kb（Smith等人，2014年；Packard和Dembowski，2021年；Kardani等人，2023年）。该基因组编码约80种蛋白质，其中近一半对病毒复制并非必需（Artusi等人，2018年；Basset等人，2025年），这为基因操作和治疗性载体的开发提供了灵活的平台（Artusi等人，2018年；González-Almela等人，2025年；Shen等人，2025年；Zhou等人，2025年）。

工程化的HSV-1载体已被广泛研究作为具有肿瘤选择性的、能够复制的溶瘤剂，并逐渐被视为溶瘤病毒治疗中的有希望的工具（Varghese和Rabkin，2002年；Fukuhara等人，2016年；Shen等人，2025年）。它们的优势包括较大的基因组容量用于插入外源基因（Varghese和Rabkin，2002年；Shen等人，2025年）、在肿瘤细胞中的高效复制、广泛的宿主细胞亲和性，以及由于其非整合性质而具有的良好安全性（Liu等人，2007年）。

HSV-1载体的临床潜力得到了多项试验的积极结果的支持，例如talimogene laherparepvec（T-VEC）已被批准用于黑色素瘤治疗（Rehman等人，2016年；Nasar等人，2024年；Shen等人，2025年）。

最初的HSV-1工程化工作集中在删除单个即时早期（IE）或早期（E）基因上，包括ICP34.5（一种神经毒力因子）、ICP4（一个主要的转录调节因子）、ICP27（一个转录后调节因子）和UL39（ICP6，编码核糖核苷酸还原酶亚基），以增强肿瘤选择性并降低对正常细胞的毒性（Peters和Rabkin，2015年；Koch等人，2020年；Kuroda等人，2020年；Shen等人，2024年）。

尽管这些单基因缺失突变体在正常细胞中的复制能力减弱，但仍然存在残留的毒性，因此人们开发了具有改进安全性的多基因缺失构建体，这些构建体目前正在进行临床前评估（Peters和Rabkin，2015年；Koch等人，2020年；Shen等人，2024年）。这些多基因HSV-1载体结合了ICP34.5、ICP6和ICP47等基因的缺失，以进一步限制在肿瘤细胞中的复制，同时将毒性降至最低（Todo，2002年；Koch等人，2020年）。

重组HSV-1的生成通常依赖于穿梭载体介导的同源重组，即将病毒基因组DNA与携带同源序列的质粒共转染，从而实现靶向的基因组整合（Goins等人，2008年）。

重组1型单纯疱疹病毒（HSV-1）可以通过多种策略生成。在本研究中，我们采用了穿梭载体介导的同源重组方法，即将与病毒基因组同源的序列携带的质粒与纯化的HSV-1 DNA共转染，以实现精确的基因组整合。虽然基于BAC的方法可以绕过某些DNA纯化步骤并加快操作速度，但穿梭载体方法仍然是用于靶向HSV-1基因组修饰的广泛使用且可靠的技术（Cheng等人，1997年；Li等人，2011年；Lin等人，2016年；Kelishadi等人，2023年；Kelishadi等人，2024年）。

为了解决这些限制，人们开发了结合荧光报告基因与抗生素抗性基因（如嘌呤霉素N-乙酰转移酶（pac）的双重选择策略。嘌呤霉素通过模拟氨酰-tRNA并诱导翻译过程提前终止来抑制蛋白质合成，使其成为有效的选择剂。表达pac基因的细胞会获得抗性，从而富集出基因改造的细胞群体（Nagahashi等人，2013年；Aviner，2020年）。

嘌呤霉素在病毒学中的应用主要侧重于选择转染的宿主细胞（Sánchez-Puig和Blasco，2000年；Lin等人，2016年）；它对病毒（包括HSV-1）的直接抗病毒活性尚未得到证实。有一些关于其对病毒复制的间接影响的报道，可能是通过细胞应激反应介导的，例如针对流感病毒（Pilcher和Hobbs，1966年）和新城疫病毒（Wilson和LoGerfo，1964年），但这些效应被认为是次要的且研究不够充分。

在本研究中，我们介绍了一种基于EF1α启动子驱动的GFP–PAC共表达盒的纯化方案的开发和优化。这种双重选择系统实现了对重组HSV-1的嘌呤霉素选择和基于荧光的鉴定，显著加快了分离过程，提高了纯度，并提升了治疗性载体生产的整体效率（Wang等人，2025年）。

细胞系、病毒和质粒

Vero（非洲绿猴肾细胞；NCBI C101）和BHK-21（幼仓鼠肾细胞；NCBI C107）细胞系来自伊朗国家细胞库（NCBI）和伊朗巴斯德研究所，并确认无微生物污染。细胞在含有10%热灭活的胎牛血清（FBS；Gibco，德国）和1%青霉素-链霉素（Gibco，德国）的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，德国）中培养。培养条件为37°C。

嘌呤霉素对Δγ34.5 HSV-1（红色）复制的影响评估

为了评估嘌呤霉素对Δγ34.5 HSV-1复制的影响，将接受嘌呤霉素处理的细胞与未处理的对照组进行比较，两者在病毒MOI（感染复数）上保持一致，然后比较BleCherry表达和病毒复制情况。通过倒置荧光显微镜观察（图2A）和斑块测定（图2B）发现，接受嘌呤霉素处理的细胞表现出较低的BleCherry表达，表明病毒复制显著减少。

UL37/UL38穿梭供体载体中嘌呤霉素抗性盒的功能验证

Δγ34.5

讨论

在这项研究中，我们开发并验证了一种基于GFP–PAC共表达盒的双重选择系统，旨在克服传统斑块纯化方法的固有局限性。传统的斑块测定依赖于视觉筛选，这一过程劳动密集、耗时，并且常常受到亲本病毒复制优势的干扰。通过结合抗生素选择和基于荧光的鉴定方法，所提出的方法提高了...

未引用的参考文献

(Kardani等人，2023年；Li等人，2011年；Roizman和Roane，1964年)

资助

这项工作作为伊朗巴斯德研究所的博士生项目得到资助（项目编号：TP-9460）。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿的撰写。

作者贡献声明

Mishar Kelishadi：撰写——原始草稿、可视化、验证、软件使用、资源准备、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理、概念构建。Alijan Tabarraei：撰写——审阅与编辑、资源协调。Kayhan Azadmanesh：撰写——审阅与编辑、监督工作、资源管理、项目统筹。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。ChatGPT（版本4，OpenAI）仅用于语言编辑；所有科学内容、数据分析和结论均由作者独立完成。

致谢

作者感谢伊朗巴斯德研究所病毒学系和再生医学与生物医学创新实验室以及戈勒斯坦医科大学病毒学系和综合研究实验室的所有人员在本项目中的协助。