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本研究利用EuDPA作为发光标签与手性探针，结合拉曼显微术、圆偏振发光（CPL）与分子动力学（MD）模拟，揭示了胶原纤维生成过程，为蛋白质聚集监测、纤维化病理及仿生材料设计提供了新方法。
2 结果与讨论
2.1 借助镧系元素拉曼标签对胶原纤维进行成像
作为一项无标记技术，拉曼显微术通过利用分子独特的振动指纹提供化学对比度。本研究采用一种水溶性铕(III)三(二吡啶甲酸)络合物（Na3[Eu(DPA)3]，简称EuDPA）作为选择性镧系元素发光标签来可视化胶原纤维。该探针可结合胶原，并通过其超灵敏的Eu3+发射带（5D0→7F2跃迁，约616 nm）被检测到。该发射带在拉曼光谱中出现在约2555 cm-1处，与大多数振动谱带一样窄。对这个EuDPA特异性峰进行光谱绘图，揭示了与胶原蛋白C-H伸缩带（约2935 cm-1）共定位的扩展纤维网络，这证实了EuDPA对胶原的选择性亲和力，并使其纤维结构得以直接可视化。
在有EuDPA存在下形成的胶原水凝胶的明场显微镜观察显示，存在数十微米宽的大型宏观纤维。然而，这些水合纤维的亚微米细节不易分辨。当样品干燥后，更小的纤维/聚集体变得可见，这很可能是因为干燥过程中EuDPA浓度增加，从而促进了纤维生成。在未经研磨的样品中，EuDPA浓度在样品内变化很大，而在经过研磨的样品中则更为均匀。从偏振图像可以明显看出纤维的类晶体有序性质，而拉曼和发光图像则显示了I/II型胶原与EuDPA的共定位。在单独的I/II型胶原和单独的EuDPA对照样品中，纤维数量要少得多（或完全不存在）。值得注意的是，Eu在约2555 cm-1处的发光带强度比I/II型胶原最强的拉曼信号（CH伸缩模式，约2935 cm-1）高出两个数量级以上。
2.2 铕对胶原聚集的调控：拉曼光学活性（ROA）/圆偏振发光（CPL）光谱学
虽然镧系元素标记能够对胶原纤维进行直接的化学成像，但要更深入地理解其分子结构需要进行手性光学分析。为此，我们应用了ROA-CPL检测方案来研究EuDPA结合如何影响胶原的自组装，因为它对镧系元素络合物诱导的细微结构变化高度敏感。具有伪D3对称性的水溶性EuDPA络合物含有能够螯合含组氨酸肽和溶菌酶的配位点。在此，我们用它来研究胶原蛋白和胶原类肽中诱导的CPL光谱响应。
当EuDPA浓度低于1 mM时，在1565和1546 cm-1处记录的总发光（IR+ IL）信号是一个对应于Eu3+的5D0→ 7F0跃迁的双峰。这个特定的跃迁通常只表现出单一的发光带，双峰很可能表明EuDPA的两种对映体（Λ和Δ）在与I型胶原结合时存在竞争。随着EuDPA浓度增加（≥2 mM），这个光谱双峰逐渐变为单峰。
有趣的是，在低EuDPA浓度（≤2 mM）下，I型胶原（20 mg/mL）更倾向于结合EuDPA的Λ构型，并表现出负的CPL模式。随着EuDPA浓度增加（≥4 mM），肉眼可见胶原纤维开始形成，并且蛋白质开始倾向于结合相反的（Δ）构型的EuDPA，同时显示出反转的CPL模式。胶原I暴露于EuDPA后，拉曼谱带也出现了显著变化，表明纤维生成过程中发生了结构变化。只有当EuDPA浓度足够低（0.5 mM）时才能检测到1668 cm-1处的酰胺I振动，否则信号会被过强的Eu发光所掩盖。
我们注意到，即使在肉眼能检测到纤维之前（即EuDPA浓度低于约2 mM时），I型胶原的光谱就发生了变化。1455 cm-1处的强C-H弯曲拉曼带轻微漂移到1452 cm-1，而1426 cm-1处的弱带变得更强并轻微漂移到1424 cm-1。1033 cm-1处的拉曼带（Phe和Hyp/Pro振动）漂移到1021 cm-1。在1382、1240和1024 cm-1处检测到ROA谱带的变化。这些光谱共同表明，在EuDPA螯合作用下胶原结构发生了变化。
通过进一步增加EuDPA浓度（至≥4 mM），强烈的Eu发光阻止了在胶原纤维的CPL/ROA光谱中检测到任何新细节，但仍能检测到I型胶原更强（或新）的拉曼谱带。最显著的增强出现在1422 cm-1处的C-H变形、1257/1259 cm-1处的酰胺III振动、1021 cm-1处的Phe和Hyp/Pro振动、约810–880 cm-1处的C-C伸缩以及476 cm-1处的Hyp环拉曼谱带。在664和221 cm-1处检测到新的谱带。
这些观察结果清楚地表明，I型胶原的构象受到EuDPA的调控。当用Na2DPA滴定I型胶原时，拉曼或ROA光谱中没有记录到变化，这表明胶原与单独的DPA2-阴离子之间的相互作用极弱，确实是EuDPA几何结构的伪D3对称性对纤维生成至关重要。
通过使用低浓度I型胶原（1 mg/mL）进行滴定进一步分析了EuDPA的影响。在如此低的浓度下，单独胶原的拉曼和ROA信号几乎看不见。在螯合EuDPA后，诱导的CPL模式开始揭示EuDPA与I型胶原之间的分子间相互作用，从而对胶原本身的结构进行采样。在最低EuDPA浓度（0.02和0.1 mM）下记录到最高的归一化圆强度差。随着Eu浓度增加到约1 mM，CID值降低。当Eu/胶原比率增加到约0.5 mmol/g时，EuDPA的“Λ”构型不再占主导地位，随着更多Eu的添加，胶原原纤维/纤维开始生长。它们与EuDPA相反的“Δ”构型的假定结合产生了强CPL，尽管绝对CID比率比无纤维情况（即在较低Eu浓度下）要小。我们假设Eu-胶原结合在1到2.5 mmol/g范围内最为紧密。
与I型胶原中EuDPA络合物诱导肉眼可见的纤维生成不同，在湿态的II型胶原中没有遇到这种效应。相反，发生了沉淀或凝聚，并伴有在较高Eu浓度下类似的CPL信号反转。两种胶原类肽（(PHG)9PHA和(PPG)9PPA）表现出与在低EuDPA/胶原比率下遇到的“清澈”（透明）无纤维I型胶原相似的EuDPA结合特征，表明这些肽偏爱Λ-EuDPA构型。显然，Λ-EuDPA与(PHG)9PHA之间的结合稍紧密，如较高的CID值所示。此外，在(PHG)9PHA中检测到对应于EuDPA 5D1→ 7F2跃迁的诱导CPL双峰，与纤维生成开始前的I型胶原相似。(PHG)9PHA的浓度滴定仅显示CID的变化；与Λ构型EuDPA的结合是稳定的，并且与I型和II型胶原不同，没有遇到CPL符号的反转。
2.3 Eu-胶原相互作用的分子建模
实验数据证实，EuDPA以浓度和构型依赖的方式调控胶原构象，并且在I型胶原、II型胶原和短胶原类肽之间存在显著差异。为了在分子水平上阐明这些效应，我们进行了MD模拟，以探究镧系元素-肽相互作用并识别可能的结合模式。
与(PHG)9PHA结合时，EuDPA的“Δ”和“Λ”构型都达到了自由能最小值，距离分别约为7.6和9.6 ?。与较大距离（>约14 ?）相比，Δ型与肽的复合物在能量上与Λ型相差约2 kcal/mol。然而，这与计算误差相当，不应以定量方式与实验进行比较。对于(PPG)9PPA和两种对映体，最有利的距离值更大，分别约为11.6和12.2 ?。如此获得的稳定几何结构表明Hyp的-OH基团起着重要作用，因为它能够与EuDPA络合物的DPA配体的羧基形成氢键。然而，在EuDPA-(PPG)9PPA的MD快照中没有捕捉到明显的分子间氢键。
这些MD模拟因此可以提供对所观察数据的定性理解，尽管实际的结合位点可能更复杂，或者可能有多个EuDPA分子参与肽结合。MD数据在肽与EuDPA络合物结合方面与ROA/CPL光谱一致，并且尽管络合物与胶原类肽的相互作用相当弱，但Hyp似乎比Pro更靠近它。
在EuDPA-(PHG)9PHA模型中，Λ对映体的络合物-肽距离大于Δ对映体，这与观察到的CPL信号一致。总之，EuDPA是一种外消旋体，在溶液中同时包含两种对映体（Λ和Δ）。在低EuDPA浓度下，I型胶原与EuDPA的相互作用松散，因为没有检测到可形成原纤维，并且诱导的CPL信号很弱。EuDPA与I型胶原之间的距离对于Λ对映体也更大，就像在肽模型中一样。相反，在高EuDPA浓度下，胶原原纤维形成，并且在CPL光谱中遇到Δ对映体。确实，湿态下EuDPA-胶原原纤维的存在（即图1中证明的EuDPA与胶原的共定位）表明I型胶原和EuDPA确实彼此更接近，该络合物可能连接多个胶原链。
3 结论
我们已经证明，EuDPA络合物刺激原纤维生长，并可作为胶原纤维生成的敏感探针，通过同时记录该络合物的圆偏振发光（CPL）和胶原蛋白的拉曼散射，实现对其的直接可视化。胶原的超分子手性和该络合物的对映选择性结合参与其中。
EuDPA络合物似乎通过立体特异性相互作用调控胶原纤维生成。浓度依赖性诱导CPL光谱揭示了I型胶原对EuDPA的Λ和Δ构型的对映选择性亲和力的动态切换。这代表了相对于静态结构方法（如X射线晶体学）或整体平均技术（如NMR光谱学）的一个关键优势。
模型肽中Eu-胶原结合位点的分子动力学（MD）模拟支持了光谱学结论。它们强调了Hyp残基在与DPA配体形成氢键中的作用。MD模拟与CPL和拉曼成像数据一致，并提供了对分子结构的更深入理解。该络合物的伪D3对称性通过在超分子水平上促进胶原自组装来促进胶原-EuDPA相互作用。
目前的发现为设计具有可预测手性光学性质的基于CPL的浓度切换材料，以及寻找组织学和病理学中常用的不太特异的胶原染色替代品铺平了道路。细胞外基质因此可以被更有效地研究，这些数据也有助于开发仿生材料，例如人造（假体）血管的内衬。
