用于角膜内皮再生的仿生聚(ε-己内酯)/脱细胞角膜细胞外基质纳米纤维支架

全球角膜捐献短缺和人类角膜内皮细胞（HCECs）再生能力有限，急需开发组织工程替代方案。本研究通过共电纺聚（ε-己内酯）（PCL）与去细胞化角膜细胞外基质（dCECM）构建仿生纳米纤维支架，优化比例后获得1:1复合支架（eP1E1）。该支架具备高光学透明性（>80%透光率）、适度的亲水性（接触角50-60°）及类原生Descemet膜力学特性（J型应力-应变曲线），有效促进HCECs粘附、增殖及形成功能单层，其ZO-1和Na+/K+-ATP酶表达验证了屏障与泵功能再生。PCL/dCECM复合材料为解决角膜内皮再生难题提供了创新策略。

　　

李新宇|张世瑶|王燕

南开大学，天津 300071，中国

摘要

全球供体角膜的短缺以及人角膜内皮细胞（HCECs）有限的再生能力迫切需要组织工程替代方案。为了满足角膜内皮再生的具体要求，理想的支架应提供足够的机械支持，同时模拟天然Descemet膜的纳米拓扑结构和生物指导性微环境。在这项研究中，我们通过共电纺聚(ε-己内酯)（PCL）与去细胞化的角膜外基质（dCECM）以不同的比例制备了一种仿生纳米纤维支架。1:1的混合支架（eP1E1）最佳地结合了关键特性，包括高光学透明度（>80%的透射率）、适度的亲水性（水接触角约50–60°）以及模仿天然组织的机械性能，表现出J形的应力-应变曲线。鉴于HCECs的终末分化和对微环境的高度敏感性，这一性能特征尤为重要。eP1E1支架表现出优异的细胞相容性，促进了HCECs的牢固附着、增殖和单层细胞的形成。此外，HCECs在eP1E1上强烈表达了功能性标志物ZO-1和Na⁺/K⁺-ATP酶，证实了再生功能性内皮的屏障和泵功能的建立。我们的发现验证了PCL/dCECM复合材料作为角膜内皮再生的一种有前景且临床可行的支架，为解决供体短缺危机提供了战略性的解决方案。

引言

角膜内皮是一层位于角膜最内层的细胞，对于维持角膜透明度至关重要，因为它具有泵送和屏障功能[1]。人角膜内皮细胞（HCECs）是终末分化的细胞，在体内具有有限的再生能力[2]，其密度会随着年龄的增长或病理损伤而逐渐下降[2]。当细胞密度降至约500个细胞/平方毫米的临界阈值以下或出现显著功能障碍时，就会发生内皮失代偿。这可能导致角膜水肿、混浊以及诸如Fuchs内皮角膜营养不良和 bullous keratopathy 等病理情况，最终导致严重的视力损害或失明[3]，[4]。诸如Descemet膜剥离、自动内皮角膜移植和Descemet膜内皮角膜移植（DMEK）等外科手术已大大取代穿透性角膜移植，成为治疗晚期角膜内皮功能障碍的首选方法[5]。然而，这些手术的广泛应用受到供体短缺、免疫排斥风险和恢复时间延长的限制，因此需要寻找替代疗法[6]。

组织工程是一种解决这些限制的有前景的策略。功能性组织工程构造需要三个关键组成部分：种子细胞、支架和支持性微环境[7]。支架尤为重要，因为其性质直接决定了细胞行为和再生结果。理想的角膜内皮支架应具有适当的物理化学和光学性质、优异的生物相容性，以及模仿天然细胞外基质（ECM）的纳米纤维拓扑结构，以引导细胞组织和功能[8]。能够从纳米尺度到微尺度生产纤维的电纺支架非常适合复制Descemet膜的结构[9]，[10]。

电纺技术利用高压电场从聚合物溶液中生成连续的微米到纳米尺度的纤维。该技术在支架制备方面具有关键优势，包括高表面积与体积比、可调的孔隙率、均匀的纤维直径、成分的灵活性以及易于生物功能化[11]。重要的是，电纺纳米纤维可以紧密模拟天然ECM的拓扑特征，而重新构建Descemet膜的纳米拓扑结构并结合生物活性信号已被证明在促进人角膜内皮细胞（HCECs）的再生中起着关键作用[12]，[13]，[14]。因此，电纺技术是工程化角膜内皮的理想方法，因为HCECs的生物学行为高度依赖于它们的微环境[15]。

角膜支架的材料包括合成聚合物（如聚(ε-己内酯)（PCL）、聚乙二醇和聚乙烯醇）以及天然生物聚合物（如胶原蛋白、明胶、壳聚糖和去细胞化的细胞外基质（dCECM）[16]，[17]，[18]，[19]。合成聚合物（如PCL）具有优异的可加工性和机械可调性，但缺乏生物活性。例如，尽管PCL用途广泛且易于修改，但Kruse等人报告称PLGA/PCL混合膜无法支持培养的角膜内皮细胞形成均匀的单层或正常功能[20]。基于天然聚合物的复合支架最近表现出有希望的生物相容性、生物降解性和可调性能，为下一代生物活性材料的发展指明了方向。然而，一个关键限制是它们缺乏与天然组织相比的特异性生物化学信号[18]。相反，从天然组织中获得的去细胞化dECM保留了促进细胞附着、增殖和功能的天然生物活性成分（如胶原蛋白、层粘连蛋白和生长因子）[21]。在之前的研究中，我们优化了猪去细胞化角膜基质的电纺参数，并证明了其在层状人工角膜中作为生物活性成分的实用性，证实了基于dECM的纳米纤维为角膜细胞提供了有利的微环境[22]。因此，将dECM与合成聚合物（如PCL）结合，可以在混合支架中同时实现生物活性和机械强度。

基于这一原理，我们旨在通过以不同比例共电纺去细胞化的角膜外基质（dCECM）和PCL来制备纳米纤维支架。这种混合方法利用了dCECM中保留的潜在生物活性基序和功能因子——这些成分可能独特地促进角膜内皮再生，并提供单组分材料无法实现的生物学益处。这些复合材料的物理化学性质和生物相容性也得到了系统的评估，以评估它们作为组织工程角膜内皮支架的潜力，为角膜内皮再生提供了一种新的策略。

部分摘录

PCL/dCECM电纺纳米纤维的制备

dCECM是使用已建立的方案从新鲜猪角膜中制备的[22]。所得dCECM粉末与PCL按预定的质量比（PCL:dCECM = 1:0、3:1、1:1、1:3和0:1）混合，并在室温（26°C）下用六氟异丙醇连续磁力搅拌6小时，得到均匀的10%（w/v）复合溶液。这些溶液使用MECC 108 NANON-01A（日本）仪器进行电纺，工艺参数包括电压和收集器距离

表面形态和纤维直径

电纺技术能够制备微米到纳米尺度的纤维结构（图1A）。在这个过程中，如果喷射的聚合物溶液无法形成连续的纤维并有效收集，可能会由于溶剂蒸发和聚合物积聚而导致针头堵塞。不同比例混合的PCL和dCECM溶液表现出不同的粘度，因此需要优化电纺参数，包括电压、收集器距离和流量

结论

本研究旨在开发一种仿生角膜内皮组织工程支架，该支架在结构、成分和功能上复制了天然细胞外基质的特征。通过将dCECM整合到基于PCL的电纺纳米纤维系统中，优化的eP1E1支架表现出良好的光学、机械和生物学性能，支持功能性HCEC单层的形成。然而，仍存在一些限制，包括使用永生化细胞系的问题

CRediT作者贡献声明

李新宇：撰写–原始草稿、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。张世瑶：验证、研究、方法学、撰写 – 审稿与编辑。王燕：项目管理、概念化、监督、撰写 – 审稿与编辑、资金获取。

伦理批准和参与同意

不适用。

出版同意

不适用。

数据可用性

数据可根据要求提供。

资金来源

本研究得到了天津市重点医学学科建设（TJYXZDXK-3-004A-3）、国家自然科学基金（82271118、82501253）、南开大学视光学与视觉研究所的开放项目（NKSGZ202304）以及天津市健康研究项目（25JCQNJC00820）的资助。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

不适用。