结合转移致病质粒变体对沙雷氏菌酶活性及毒力性状的影响研究

《Environmental Microbiology Reports》：Conjugative Transfer of Disease-Encoding Plasmid Variants in Serratia spp. Alter Production of Enzymes and Virulence Properties

这项研究揭示了沙雷氏菌中可移动的致病大质粒（STAMP）在种内或近缘种间通过接合转移后，对受体菌的适应性、次级毒力因子表达及致病表型产生的复杂影响。研究发现，非天然宿主的质粒接合体会导致几丁质酶、蛋白酶等关键酶活性改变，转录组分析揭示了染色体基因（如nucA、chiA等）的差异表达。这些变化影响了昆虫病原菌的致病效率，支持了质粒-染色体协同进化假说，对理解细菌质粒介导的毒力进化及微生物生态学具有重要价值。

　　

引言

沙雷氏菌属（Serratia）中的某些菌株，如S. entomophila、S. proteamaculans和S. quinivorans，是新西兰牧草害虫Costelytra giveni（鞘翅目：金龟子科）的昆虫病原体。其毒力主要由琥珀病相关质粒（pADAP）的变体编码，这些变体统称为沙雷氏菌可转移适应性大质粒（STAMP）。有趣的是，新西兰土壤中约有40%–60%的沙雷氏菌是不携带质粒的无毒共生菌。为了进一步阐明质粒、宿主与疾病之间的进化关系，本研究将慢性和高毒力病原型的质粒通过接合转移导入受体菌株，在体外和昆虫宿主体内，系统比较了转接合子（通过接合获得供体质粒的菌株）与供体菌株及原始无质粒菌株在毒力、酶活性及适应性方面的差异。

实验方法

研究选取了代表不同毒力水平（高毒力、慢性、非致病性）和不同物种（S. entomophila和S. proteamaculans）的菌株作为供体和受体。通过接合转移，构建了一系列转接合子菌株，例如将来自高毒力菌株SpAGR96X的pAGR96X质粒转入无质粒的Se477菌株，得到Se477(pAGR96X)。实验评估了这些菌株的酶活性（包括几丁质酶、蛋白酶、脂肪酶、DNase等）、植物生长素IAA产量、对昆虫幼虫的半数致死浓度（LC₅₀）与半数致死时间（LT₅₀）、在幼虫体内的定植数量与质粒稳定性、体外生长竞争能力，并对关键菌株进行了转录组（RNAseq）分析，以探究基因表达的变化。

结果：质粒携带对酶活性与植物有益性状的影响

平板测定显示，质粒的引入改变了受体菌的次级毒力因子表达。例如，转接合子Se477(pAGR96X)的蛋白酶和几丁质酶降解活性相较于原始Se477菌株显著降低。而将原始pADAP质粒回补到其来源的消除质粒菌株Se5.6中（即Se5.6(pADAP)），其表型变化最小，表明该质粒与其原始宿主染色体存在紧密的适应关系。在IAA（吲哚-3-乙酸）产量测定中，大多数转接合子的IAA产量降低，但Sp3041(pAGR96X)的产量却增加，基因组分析发现这与菌株间ipdC基因拷贝数差异有关。

结果：转接合子对昆虫幼虫的致病力与质粒稳定性

生物测定揭示了转接合子致病表型的多样性。当质粒转入其原始宿主背景时（如Se5.6(pADAP)），其致病表型与原始供体菌SeA1M02相似。然而，当高毒力质粒pAGR96X转入不同的沙雷氏菌受体（如Se477、SeiDIA、Se5.6）时，其导致的疾病表型不一致且毒力往往减弱。例如，Se477(pAGR96X)的LC₅₀值（6.8 × 10^-6CFUs）显著高于其供体菌SpAGR96X（4.9 × 10^-4CFUs），表明需要更高剂量才能达到相同致死率。从感染幼虫中回收的细菌计数表明，到第12天时，所有测试菌株均保持了质粒，排除了实验中质粒丢失导致表型变化的可能性。

结果：体外适应性评估

在无抗生素的液体培养基中，携带非天然质粒的转接合子显示出适应性的改变。例如，在基本培养基（M9）中，Se477(pAGR96X)的生长被其无质粒亲本Se477超越。而SeiDIA(p626)在丰富培养基（LB）中生长最佳，但其在M9培养基中进入指数生长期的时间晚于其原始菌株SeiDIA，表明天然质粒在压力条件下为宿主提供了最大益处。

结果：转录组分析揭示了广泛的基因表达重编程

对Se477及其转接合子Se477(pADAP)和Se477(pAGR96X)的转录组比较发现，质粒的引入导致了广泛的染色体基因表达变化。pAGR96X的引入引起了更剧烈的转录重排（672个差异表达基因），而pADAP的引入影响相对较小（286个差异表达基因）。值得注意的是，Se477(pADAP)中有134个转录本在多个重复中均无表达，其中66%的基因位于四个预测的基因组岛上，包括一个限制修饰系统（hsdR， hsdM）和一个hipA毒素基因。具体到毒力相关基因：编码DNase的nucA基因在转接合子中显著下调；几丁质酶基因（chiA， chiB， chiD）普遍下调，这与观察到的几丁质酶活性降低表型一致；一些磷脂酶基因（如tesA， pldA， pldB）在Se477(pAGR96X)中则出现上调。

结果：质粒编码毒力因子的表达谱

比较SeA1M02（天然携带pADAP）和Se477(pADAP)的质粒基因表达发现，转接合子中大多数抗取食前噬菌体（Afp）基因和Sep毒素复合体（Tc）基因的表达显著上调（log2倍变化 > 2）。例如，afp3， afp4， afp6-afp12等基因在Se477(pADAP)中的表达量远高于在SeA1M02中。这可能是由于新宿主缺乏对质粒毒力基因簇的天然调控机制，导致了其过度表达。

讨论

本研究证明，STAMP质粒通过接合转移到非天然沙雷氏菌宿主后，会改变受体的致病表型、次级毒力因子表达和代谢物产量，并可能带来适应性代价。转接合子中染色体基因（如几丁质酶、蛋白酶基因）的下调以及质粒毒力基因（如Afp基因簇）的异常高表达，共同导致了观察到的“不一致”疾病表型和减弱的毒力。这些发现支持了STAMP质粒已与其天然宿主染色体发生物种特异性协同进化的观点。这种协同进化通过微调基因表达网络，最大化了质粒的益处（如毒力），同时最小化了其代谢负担，从而解释了质粒悖论——即尽管质粒常带来适应性成本，但它们仍能在细菌种群中持久存在。这项研究为了解细菌通过水平基因转移获得新性状的进化限制和生态后果提供了重要见解。