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基于MOF-818@aptamer的信号增强探针用于高灵敏外泌体检测，通过cDNA-aptamer双链解离和目标介导的aptamer释放策略实现电化学检测，在75–1.5×10^7 particle/μL范围内线性响应，检测限23 particle/μL，验证了其对乳腺癌早期诊断的有效性。
Mohammad Ali Farzin | Seyed Morteza Naghib
伊朗科学技术大学（IUST）先进技术学院纳米技术系，德黑兰，伊朗
摘要
本研究提出了一种基于目标诱导的适配体置换和无酶电化学信号增强相结合的癌症诊断方案。MOF-818@适配体基信号放大探针被用于构建一种电压生物传感器，通过互补DNA（cDNA）-适配体双链解离机制和目标介导的适配体释放识别策略，实现对CD63阳性外泌体（CD63+）的灵敏检测。由于MOF-818含有三核铜中心，它可以有效模拟儿茶酚氧化酶的酶促行为。因此，将这种MOFzyme替换为仅含有Zr离子的MOF-808会导致电极电流强度的减弱。在该传感策略中，CD63阳性外泌体首先被模拟儿茶酚氧化酶的MOF-818@适配体特异性捕获，随后适配体从cDNA/AuNPs-CPE上解离，从而导致儿茶酚峰电流显著下降。在最佳pH值、孵育时间和杂交条件下，差分脉冲伏安法（DPV）电流响应与CD63阳性外泌体浓度（范围为75–1.5×10^7颗粒/μL）之间存在良好的线性关系，检测限（LOD）为23颗粒/μL。该检测范围涵盖了文献中报道的大多数外泌体浓度水平，包括癌症患者和健康个体。模拟血清样本的分析显示，三次重复实验中CD63阳性外泌体的回收率均高于95%，表明基于MOFzyme的适配体传感器具有很高的检测能力。ELISA分析也证实了生物传感器的结果。
引言
分化簇抗原63（CD63）是一种广泛使用的外泌体表面生物标志物，在激活血小板和T细胞（作为免疫系统的重要组成部分）方面起着重要作用[1]、[2]。CD63积极参与外泌作用和囊泡运输。有趣的是，在某些类型的癌症中，CD63会促进肿瘤生长，而在其他类型癌症中则抑制肿瘤生长[3]。由于CD63在某些肿瘤细胞（如MCF-7和黑色素瘤细胞）中的表达增加，它在这些癌症的诊断和治疗中起着关键作用。尽管CD63的过表达可以抑制肝细胞癌细胞的迁移，但它还能减少头颈部鳞状细胞癌的转移[4]。CD63阳性外泌体（CD63+）的浓度与MCF-7癌细胞的恶性潜能相关[5]、[6]。实际上，这种四跨膜蛋白在外泌体表面的普遍存在使其成为乳腺癌早期诊断的理想靶标。临床样本中外泌体浓度极低，这促使研究人员专注于高精度和高灵敏度的分析方法。为此，常将一些信号放大方法结合到电化学生物传感器中以提高检测灵敏度。基于信号放大的生物传感器能够检测生物流体中的超微量生物标志物。在众多信号放大策略中，纳米酶介导的信号增强方法受到了广泛关注。
随着生物分子传感检测需求的不断增加，人们投入了大量研究努力来开发电化学生物传感器的独特功能，例如在复杂生物基质中的直接分析和灵敏度提升。这一目标主要通过使用纳米酶来实现。纳米酶或合成酶因其类似酶的催化活性而在电化学生物传感器领域带来了新的机遇[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。纳米酶领域的最新进展突显了集成传感系统在生物医学应用中的重要性。近年来生物传感器研究的热门话题之一是纳米酶，它直接与电化学信号放大相关。有趣的是，将纳米酶与诊断传感器结合可以提高检测性能，同时降低分析成本。此外，集成传感技术通过提高准确性、灵活性和宽检测范围增强了诊断能力。这些人工酶不仅能够提高生物测定的灵敏度，还能改善生物传感器的性能，体现在分析指标和选择性方面。虽然它们继承了天然酶的优点，但也能克服天然酶的局限性，如高成本和化学及热力学不稳定。值得注意的是，这些纳米结构不仅通过模拟天然酶表现出优异的催化活性，还便于大规模生产[13]。总体而言，纳米酶的高稳定性、长寿命、良好的生物安全性、优异的生物相容性、可调的活性、易于大规模制造以及经济可行性使其成为生物传感器设计的理想候选者。
具有超高孔隙率的金属有机框架（MOFs）是一类特殊的纳米酶。这些三维晶体纳米材料由金属离子与多功能有机连接剂配位形成。由于MOF工程化的纳米酶（MOFzymes）具有高催化活性、丰富的催化位点、易于合成、生物相容性、简单的功能化、优异的稳定性和低成本[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]，它们已被广泛应用于生物传感器的制造。此外，通过将适配体引入MOFzymes，研究人员为新型适配体纳米酶的设计开辟了新的可能性。
本文提出了一种方便且灵敏的外泌体检测策略，用于乳腺癌的早期诊断，该策略结合了两种信号放大方法：目标触发的适配体置换/解离机制和MOFzyme介导的信号增强策略。在此传感方案中，CD63阳性外泌体首先被模拟儿茶酚氧化酶的MOF-818功能化适配体（MOF-818@aptamers）特异性捕获，随后适配体通过置换反应从互补DNA链（cDNA）上释放。实际上，CD63+与MOFzyme@aptamer的相互作用会使其从金纳米颗粒修饰的碳糊电极（AuNP/CPE）表面解离。适配体通常会经历目标诱导的结构变化以实现传感功能。目标诱导的置换模式在制备具有优异选择性和超低检测限（LOD）的灵敏电化学生物传感器方面具有巨大潜力[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]。
材料
纯石墨粉（GP）、三氟乙酸、ZrOCl?·8H?O、四氯金酸钠（NaAuCl?）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、Cu(NO?)?·3H?O、丙酮、儿茶酚、1H-吡唑-4-羧酸（H?PyC）、三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、牛血清白蛋白（BSA）和炭黑（CB）均来自Sigma-Aldrich公司。胺化的CD63特异性适配体也由该公司提供。
扫描电子显微镜（SEM）
使用德国ZEISS EVO系列模块化扫描电子显微镜（SEM）评估了基于碳糊的导电墨水的形态。如图2A所示，石墨呈现层状结构，这与这种碳质材料的特性相符。可以看出，炭黑颗粒在石墨层上分布均匀，这种良好的分散性有助于增加碳糊的表面积，从而改善电子传输[29]。
结论
在本传感方案中，提出了一种类似儿茶酚氧化酶的MOF-818纳米酶作为信号放大标签，其对儿茶酚氧化具有高特异性。当MOFzyme标记的适配体与固定在AuNPs-CPE上的cDNA杂交时，在儿茶酚存在下会观察到强烈的伏安峰。随着外泌体浓度的增加，由于适配体从电极表面脱落，氧化电流强度显著下降。
CRediT作者贡献声明
Mohammad Ali Farzin：撰写原始稿件、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。
Seyed Morteza Naghib：审稿与编辑、项目监督、方法学设计、实验研究、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
