基于磁性介孔二氧化硅纳米载体的适配体变色生物传感器能够灵敏地检测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）

开发了一种基于磁性多孔二氧化硅纳米载体和适配体的颜色反应生物传感器（MMNCS），用于快速、灵敏检测铜绿假单胞菌。该传感器具有15分钟内完成检测、0.8 CFU/mL超低检测限，并在不同样本中表现良好，为早期病原菌筛查提供了低成本解决方案。

　　

孙凯迪|张艳|郑清音|秦丹|闫鹏|王丽燕|陈浩|陈凌鑫|毕丽燕

滨州医学院特殊教育与康复学院，中国烟台264003

摘要

铜绿假单胞菌是一种适应能力强且具有耐药性的革兰氏阴性细菌，对公共卫生构成了严重威胁。我们开发了一种基于磁性介孔二氧化硅纳米载体的适配体比色生物传感器（MMNCS），用于快速、灵敏地检测铜绿假单胞菌。在该生物传感器中，磁性介孔二氧化硅纳米颗粒作为辣根过氧化物酶（HRP）的载体，而适配体则作为特异性捕获探针来识别细菌。在铜绿假单胞菌存在的情况下，生物传感器会锚定在细菌表面，导致孔隙闭合并抑制HRP对TMB的氧化。所建立的比色生物传感器在广泛的浓度范围内（10至10⁵ CFU/mL）表现出优异的性能，具有高灵敏度（检测限为0.8 CFU/mL）和快速的检测时间（15分钟）。此外，MMNCS平台在自来水、人工尿液、人工唾液和人血清样本中的检测结果显示，回收率在95.47%至105.65%之间，相对标准偏差在0.93%至4.17%之间。该方法提供了一种低成本、灵敏且快速的病原菌早期筛查检测平台。

引言

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，被认为是关键病原体，可侵袭免疫功能低下的个体，引起菌血症、尿路感染、手术部位感染和肺炎[1]、[2]。因此，快速、灵敏地检测这种病原菌具有重要的临床意义，可以预防医院内细菌感染[3]。细菌检测依赖于多种成熟的技术，包括培养和菌落计数、免疫测定以及核酸扩增，但这些方法受到复杂设备、专业操作人员及耗时过程的限制[4]、[5]。比色生物传感器的最新进展使得病原菌的检测变得快速、超灵敏且能够实现多重分析。由于基于催化系统（如辣根过氧化物酶[6]、葡萄糖氧化酶[7]和卵白素A[8]）的比色生物传感器具有选择性和高效底物转化的独特优势，它们已在公共卫生和安全领域得到广泛应用[9]、[10]。然而，这些酶存在一些固有的局限性，包括结构不稳定、易受环境变化（如温度和pH值）的影响，以及基质依赖性的干扰效应[11]、[12]。这些缺点对比色生物传感器的稳定性、重复性和实际应用性提出了挑战。通过使用无机颗粒、水凝胶和金属有机框架（MOF）等T，可以改善检测性能，增强信号强度，并促进缓释控制的催化反应[14]。最近，赵等人将GOD固定在硼酸功能化的分级多孔MOF上，用于一步葡萄糖检测[15]；李等人报道了一种纳米酶磁性纳米混合器，能够高效固定天然酶，实现代谢疾病生物标志物的多重检测[16]。

尽管在酶固定复合材料优化方面取得了进展，但其固有的局限性仍限制了其实际应用效果。首先，酶从载体网络中的非特异性泄漏可能会产生虚假信号，从而影响分析平台的准确性。其次，酶在密集框架中的深度固定可能导致过度嵌入，降低活性位点的可及性，进而降低催化性能和分析灵敏度。此外，某些载体材料的疏水性和缺乏功能性基团也给均匀酶分散和有效固定带来了挑战[17]、[18]。为了解决这些问题，介孔二氧化硅纳米颗粒被用作酶固定的新型载体[19]。这种载体具有较大的孔径、较高的表面积和优异的亲水性，能够实现高效的酶封装和多样的表面修饰[20]、[21]。因此，基于介孔二氧化硅纳米颗粒的载体表现出更好的负载能力和稳定性，确保了高灵敏度比色检测所需的催化位点均匀分布[22]。同时，基于酶的比色生物传感器的特异性取决于识别元件，这可以避免相似分子的干扰[23]。作为新一代生物识别元件，适配体具有许多显著优势，包括高特异性[24]、出色的亲和力、较长的筛选时间和易于修饰[25]、[26]、[27]。钟等人开发了一系列基于适配体的病原菌检测生物传感器平台[28]、[29]。

在这里，我们设计了一种基于磁性介孔二氧化硅纳米载体的适配体比色生物传感器（MMNCS），用于高度灵敏地检测铜绿假单胞菌。由于介孔二氧化硅纳米颗粒具有较大的孔径和较高的比表面积，它们被用作辣根过氧化物酶（HRP）的载体。TMB可以进入比色生物传感器，并被HRP催化生成显色产物氧化TMB（oxTMB）。在铜绿假单胞菌存在的情况下，MMNCS平台通过适配体介导锚定在细菌表面，导致孔隙闭合，抑制TMB的氧化反应。我们预期该比色生物传感器能够在一定浓度范围内检测目标细菌。同时，通过选择特定的适配体，该生物传感器也可以用于其他类型病原菌的检测。

部分内容摘要

化学品

六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O，99%）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%）、三钠柠檬酸二水合物（C₆H₅Na₃O₇·2H₂O）、三水合醋酸钠（C₂H₃NaO₂·3H₂O）、乙二醇（C₂H₆O₂）、无水乙醇（C₂H₆O）、环己烷（C₆H₁₂）、四乙基正硅酸盐（TEOS）和氢氧化铵水溶液（NH₃·H₂O）均购自中国上海的中药化学试剂有限公司。三乙醇胺（TEA）和（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）也来自相同公司。

磁性介孔二氧化硅纳米载体集成适配体比色生物传感器（MMNCS）的制备与原理

图1展示了磁性介孔二氧化硅纳米载体集成适配体比色生物传感器（MMNCS）的制备原理。水溶性磁性Fe₃O₄纳米颗粒通过一锅法溶胶-热反应合成[32]。如图1A所示，在TEA活化的溶胶-凝胶过程中，TEOS和CTAB溶解在水/环己烷双相系统中，使硅酸盐寡聚物和CTAB在Fe₃O₄纳米颗粒表面共组装，形成了介孔结构

结论

总之，我们开发了一种基于磁性介孔二氧化硅纳米载体的适配体比色生物传感器（MMNCS）。由于介孔二氧化硅纳米颗粒具有较大的孔径和较高的比表面积，可以高效负载辣根过氧化物酶。在优化条件下，该比色生物传感器能够在15分钟内以低至0.8 CFU/mL的检测限高度灵敏地检测铜绿假单胞菌。

CRediT作者贡献声明

孙凯迪：研究、资金获取、数据分析。张艳：方法学设计、研究、数据分析。郑清音：验证、监督、数据分析、数据管理。秦丹：验证、资源提供、数据分析。闫鹏：软件开发、资源支持。王丽燕：资源协调、方法学设计。陈浩：初稿撰写、方法学设计、研究。陈凌鑫：修订与编辑、监督、资金获取、概念构思。毕丽燕：初稿撰写

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本项工作得到了山东省重点研发计划（2022CXPT019）、山东省科学技术基金（ZR2021MB091、ZR2024QB335）、国家自然科学基金（21605005、22304149、22404172、22204006）的财政支持。此外，该项目还得到了烟台市“人才引进（团队）”专项资金的资助。