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阿尔茨海默病与卒中后痴呆早期快速检测的多标记电化学免疫传感器研究。该传感器通过金纳米颗粒和二硫苏代琥珀酰亚胺共价交联抗体，实现血浆中GFAP（100-1000 pg/mL）和pTau181（0.1-1 pg/mL）的同步检测，检测限分别达9.95 pg/mL和0.044 pg/mL。临床验证显示双标志物联合检测的AUC（0.93）显著优于单一标志物（GFAP 0.80，pTau181 0.85），且与MMSE评分呈强负相关（r=-0.742，-0.711）。相比传统ELISA和Simoa平台，本方法具有更快的检测速度（30分钟）、更低的样本需求（5 μL）和更高的成本效益，适用于资源有限地区的早期筛查和动态监测。
上治坚|林美君|张美瑜|陈永川|张佳萱|王立春|陈荣志
台湾新竹国立阳明交通大学智能生物电工程研究所，300
摘要
由于缺乏针对关键血浆生物标志物的快速、多重检测方法，早期和准确检测阿尔茨海默病（AD）和卒中后痴呆（PSD）具有挑战性。这两种疾病都具有神经炎症和tau蛋白病变等病理特征。本文报道了一种双生物标志物电化学免疫传感器，仅需5 μL人血浆即可在30分钟内同时检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和丝氨酸-181位点磷酸化的tau蛋白（pTau181）。该平台采用喷涂碳电极，并修饰有金纳米颗粒和二硫代琥珀酰亚胺丙酸酯（DSP），以实现高效的抗体固定和增强的电流响应灵敏度。GFAP的检测限达到9.95 pg/mL（线性范围：100–1000 pg/mL），pTau181的检测限达到0.044 pg/mL（对数线性范围：0.1–1 pg/mL）。对54名疑似认知障碍的卒中患者和20名健康对照者的血浆进行临床测试显示，这些生物标志物与简易精神状态检查（MMSE）得分呈强烈负相关（GFAP：rs = ?0.742；pTau181：rs = ?0.711；p < 0.001），并且生物标志物之间存在正相关（rs = 0.788）。结合使用这两种标志物的诊断准确性优于单独使用任一标志物（GFAP：0.80；pTau181：0.85）。这种快速、经济且灵敏的多重检测传感器在速度和样本效率方面优于ELISA。与传统MMSE不同，它可以有效量化AD的进展，使其成为资源有限环境中的早期筛查、临床监测和大规模研究的有效工具。注册号：台中荣民综合医院机构审查委员会，TRN：CE24229C，注册日期：2024年7月1日。
引言
痴呆是一种慢性进行性神经退行性疾病，目前尚无改变疾病进程的治疗方法。阿尔茨海默病（AD）是最常见的形式，占痴呆病例的60–80% [1]。现有疗法只能延缓疾病进展，因此早期检测和预防至关重要。AD的标志性病理特征包括淀粉样斑块（神经元周围的不可溶性β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积）和神经纤维缠结（NFTs，由神经元内的过度磷酸化tau蛋白形成）[2]。这些特征有助于区分AD患者和健康个体的大脑。然而，它们不仅表征了AD，还导致了更广泛的神经功能障碍。
一个例子是AD与卒中之间的双向关系，这使得临床管理变得复杂。脑淀粉样血管病（CAA）在AD中很常见，会增加卒中风险。相反，卒中使AD的风险增加约60% [3]。共同的病理机制包括神经炎症、氧化应激、血脑屏障（BBB）破坏和信号通路失调 [4]。卒中后胶质纤维酸性蛋白（GFAP）水平升高表明存在神经炎症和BBB渗漏，这会损害Aβ的清除并加重AD的病理 [5]。卒中患者在一年内发展为痴呆的风险几乎是正常人的两倍，而与AD相关的血管脆弱性使患者更容易再次发生卒中 [6]。
GFAP是一种主要在星形胶质细胞中表达的III型中间丝蛋白，反映了星形胶质细胞的激活，并与卒中的严重程度和神经功能缺陷相关 [7]。血浆中的GFAP水平还可以预测轻度认知障碍（MCI）向痴呆的转化，在AD患者中升高表明存在神经炎症、海马体萎缩和认知衰退 [8]、[9]。尽管GFAP并非AD特有，但它可作为中枢神经系统损伤反应的敏感标志物 [10]、[11]。
丝氨酸-181位点磷酸化的tau蛋白（pTau181）是AD的高度特异性生物标志物，反映了tau蛋白的病理变化和神经纤维缠结的进展 [12]。脑脊液和血浆中pTau181水平的升高在区分AD与其他神经退行性疾病方面具有很强的诊断能力，并能可靠地区分疾病的无症状期、前驱期和晚期 [13]。因此，虽然pTau181直接反映了tau蛋白的病理变化和NFT的进展，但GFAP提供了关于星形胶质细胞激活和周围神经炎症环境的补充信息，从而更全面地理解AD的病理生理学 [14]。
灵敏的多重生物传感平台对于检测血浆中的GFAP和pTau181至关重要。传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）虽然可靠，但耗时较长（通常每个孔需要3–5小时），且需要大量样本（每个孔50–100 μL）。超灵敏的Simoa平台可以实现亚pg/mL的检测限，比传统ELISA低约10–100倍，但需要昂贵的设备、较长的测量时间（每个96孔测试约1–2小时加上设置时间），以及较高的样本量（每次测试约100–150 μL），这限制了其在资源有限环境中的应用。
在本研究中，引入了喷涂碳电极（D-SPCE），其配置减少了检测时间和试剂消耗，最小化了批次间差异，并提高了检测的可靠性。已经使用D-SPCE对不同的生物标志物进行了多次检测。例如，Martínez-García等人使用还原氧化石墨烯（rGO）和来自4-氨基苯甲酸（4-ABA）的重氮盐修饰了D-SPCE，实现了胃饥饿素（GHRL）和肽YY（PYY）的同时检测，检测限分别为7 pg/mL和2.84 pg/mL [15]。此外，Yunus等人设计了一种基于4-氨基苯和EDC/NHS化学修饰的D-SPCE的双适配体传感器，用于检测结核病抗原CFP10和MPT64，检测限分别为1.68 ng/mL和1.82 ng/mL，并用临床样本验证了该系统 [16]。这些例子共同强调了基于D-SPCE的平台在临床应用中实现灵敏和可靠多重检测的日益增长的趋势和巨大潜力。
一般来说，工作电极的表面——分析物结合和信号生成的关键界面——通过交联剂进行功能化，以固定抗体。所选交联剂显著影响生物传感器的灵敏度和检测限 [17]。金纳米颗粒（AuNPs）因其易于合成、生物相容性和优异的导电性而被广泛用于修饰碳电极 [18]。Beatriz R. Martins等人报告称，AuNP修饰的碳电极的性能优于裸露的碳电极和金电极 [19]。AuNPs有多种形状，包括纳米棒、立方体、球体和纳米笼；球体因其抗聚集性、均匀覆盖、光滑表面和增强的电子传输能力而受到青睐 [20]。性能取决于颗粒大小，约10–20 nm的AuNPs可以提高信号强度、稳定性和检测限 [21]。在免疫传感器中，AuNPs可以非共价结合抗体；然而，这种结合对pH敏感，且由于随机取向容易导致活性丧失。共价固定提供了更高的稳定性，EDC/NHS化学是一种常用的方法——通过激活羧基与抗体胺反应——尽管需要额外的步骤和严格的条件 [22]。
双功能交联剂提供两个反应位点：一个用于稳定地固定AuNPs，另一个用于快速结合生物分子 [22]。与物理吸附或EDC/NHS相比，它们提供了更高的稳定性和更简单的操作 [23]。本文选择了二硫代琥珀酰亚胺丙酸酯（DSP）在自组装单层（SAMs）中形成强金-硫键，其键能高于二硫化物。DSP修饰的AuNPs具有最佳的硫间距，从而实现均匀覆盖和减少聚集 [24]。DSP在温和条件下也能发挥作用，无需额外激活，并能定向固定生物分子，从而提高灵敏度 [25]。DSP-SAMs的抗体固定效率高于EDC/NHS [26]。SAM的覆盖程度取决于DSP的浓度，这又影响灵敏度和稳定性 [26]。DSP的功能化已应用于金微电极 [27]、石英晶体微天平 [28] 和表面等离子体共振传感器 [29]。例如，Park和Kim发现DSP修饰的金电极比单独使用蛋白质A或G更有效地捕获沙门氏菌，避免了因弱相互作用导致的信号偏差 [30]。
为了满足对早期和准确检测阿尔茨海默病和卒中相关病理的日益增长的需求，本研究整合了AuNPs和DSP修饰的D-SPCE，开发了一种快速、灵敏且多重的电化学生物传感器，用于检测血浆中的GFAP和pTau181——这两种生物标志物与神经退行性疾病高度相关。这种方法提高了稳定性和传感性能，同时减少了耗时的预处理步骤。该平台为临床应用中的认知衰退监测提供了有前景的方法。
仪器和测量
所有电化学测量均使用CHI 920D电化学工作站（CHI Instruments，美国）进行。免疫传感器构建在一次性双碳电极（ED-D2PE-C10，Micrux Technologies，西班牙）上，包括两个碳工作电极（WE1和WE2，每个2.5 mm × 1 mm），它们共享一个共同的喷涂银参考电极和一个碳辅助电极。所有电极均打印在柔性的高阻抗聚对苯二甲酸乙二醇酯基底上
每个修饰步骤的循环伏安法分析
如图2所示，循环伏安法（CV）用于监测D-SPCE表面的每个修饰步骤。未经修饰、清洁的D-SPCE显示出清晰的氧化还原峰，阴极（Ipc）和阳极（Ipa）峰电流分别为2.754 × 10^?5 A和?2.092 × 10^?5 A，峰电位差（ΔE）为0.31 mV，表明表面清洁且导电。
结论
本研究开发了一种基于D-SPCE的电化学免疫传感器，该传感器经过DSP和AuNPs修饰，可用于同时检测血浆中的GFAP和pTau181。DSP实现了稳定的抗体固定，而AuNPs通过高表面积与体积比和导电性改善了电化学信号。传感器具有高灵敏度，GFAP的线性范围为100–1000 pg/mL（检测限：9.95 pg/mL），pTau181在0.1–1 pg/mL范围内表现出对数响应（检测限：
临床试验编号和伦理声明
本研究得到了台中荣民综合医院机构审查委员会（批准编号CE24229C）的批准，并遵循所有相关伦理指南，包括赫尔辛基宣言。所有参与者在参与研究前均获得了书面知情同意和血液样本采集的同意。
CRediT作者贡献声明
上治坚：撰写——原始草案、方法学、研究。林美君：撰写——审阅与编辑、验证、方法学、研究。张美瑜：验证、资源。陈永川：验证、资源。张佳萱：撰写——审阅与编辑、形式分析。王立春：监督、项目管理。陈荣志：验证、资源、项目管理。写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本研究时，作者使用了ChatGPT 5和Grok 3来提高可读性。使用这些工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对研究内容负全责。
资助
本研究部分由台湾国家科学技术委员会（NSTC 114-2221-E-A49-090、NSTC 114-2321-B-A49-002、NSTC 114-2640-B-A49-001）资助和支持。
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：陈荣志报告称获得了国家科学技术委员会的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢国立阳明交通大学生物科学技术系的张佳萱教授提供的仪器，使得金纳米颗粒的定性分析成为可能。
