铁稳态失调会引发MELAS纤维细胞的线粒体损伤和铁死亡（ferroptosis）易感性

研究显示MELAS患者成纤维细胞中低（MELAS Low）和高（MELAS Hi）杂合子水平对罗丹尼醇诱导的线粒体应激反应不同，MELAS Hi细胞Fe2?累积更显著，且铁螯合剂脱氧铁胺预处理可逆转细胞存活率及线粒体形态损伤，证实铁稳态失衡与线粒体损伤是MELAS病理核心放大器，提示铁螯合治疗潜力。

　　

林宇涵|王晓文|李宇安|陈婷雅|连伟雄|王凤生|兰敏瑜|刘家伟|林祖恭

台湾高雄长庚大学医学院线粒体研究与医学中心，高雄长庚纪念医院

摘要

线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和中风样发作（MELAS）综合征由mtDNA突变引起，会破坏线粒体功能并引发氧化应激。本研究探讨了铁死亡（ferroptosis）在MELAS患者来源的成纤维细胞中的关键作用，这些成纤维细胞携带低（MELAS^Low）或高（MELAS^Hi）水平的线粒体DNA异质性，并受到罗藤酮（rotenone，一种复合体I抑制剂）诱导的线粒体应激的影响。与正常人真皮成纤维细胞（NHDF）相比，罗藤酮显著降低了MELAS成纤维细胞的存活率，同时增加了细胞/线粒体中的活性氧（ROS）水平、脂质过氧化反应，以及MELAS^Hi细胞中SOD1的稳定性降低而SOD2略有下降。罗藤酮在MELAS^Low细胞中诱导了Fe²⁺的积累，而在MELAS^Hi细胞中则无论在基线还是罗藤酮处理后都表现出更严重的Fe²⁺升高。通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和半胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白（xCT），观察到MELAS^Hi细胞对铁死亡的敏感性增强；此外，与NHDF相比，MELAS亚型中的铁死亡抑制因子FSP1表达下调。铁稳态失调，MELAS细胞中的转铁蛋白受体（TFRC）和二价金属转运蛋白1（DMT1）表达减少。非毒性的去铁胺（DFO；1–100 μM）预处理能够提高细胞存活率，减轻线粒体碎片化，并恢复受压MELAS成纤维细胞的正常形态。这些数据表明Fe²⁺失衡和线粒体损伤是MELAS病理的核心机制，从而为使用铁螯合疗法来减轻氧化损伤和保护细胞活力提供了依据。

引言

线粒体是一种多功能细胞器，对细胞存活至关重要，参与多种细胞功能，包括能量产生、生物合成和铁代谢。细胞吸收外源性铁并将其转运到线粒体中，用于合成辅因子（如血红素和铁硫簇），这些辅因子是参与氧化还原反应、DNA合成和其它细胞过程的酶所必需的（Rouault和Tong，2005）。含铁硫簇和血红素的蛋白质是电子传递链（ETC）内膜复合体的组成部分。铁是线粒体内最丰富的金属（Atkinson和Winge，2009）；维持铁平衡对ATP生成也至关重要（Lill和Mühlenhoff，2008）。已知线粒体在调控细胞死亡中起关键作用，包括凋亡（Bock和Tait，2020）、焦亡（Li等人，2021）、坏死性凋亡（Weindel等人，2022）和铁死亡（Gao等人，2019）等形式的细胞死亡。

铁死亡的特点是铁依赖性的脂质过氧化和异常铁积累（Jin等人，2024）。它是一种不依赖于半胱天冬酶的调控性细胞死亡形式，表现为线粒体结构异常、小线粒体出现、线粒体外膜破裂、线粒体膜密度增加以及线粒体嵴数量减少或丢失（Yang和Stockwell，2008）。与其他类似坏死的调控性细胞死亡途径不同，铁死亡不会导致明显的质膜破裂或能量代谢衰竭；它保持完整的质膜和正常的细胞核大小，且无染色质浓缩（Dionísio等人，2021）。其主要生化过程涉及细胞内谷胱甘肽（GSH）的耗竭和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）活性下降。GPX4催化的还原作用无法完全代谢多余的脂质过氧化物，导致活性氧（ROS）大量积累（Liu等人，2023）。线粒体功能障碍被认为是铁死亡的特征之一（Battaglia等人，2020）。线粒体损伤进一步加剧氧化应激，参与多种疾病（包括癌症和器官损伤）的发病机制，并与神经退行性疾病密切相关（Yan等人，2021；Liang等人，2022）。

铁代谢、脂质代谢和氨基酸代谢是调控铁死亡的主要代谢途径。循环中的三价铁离子（Fe³⁺）通过质膜上的转铁蛋白（TF）/转铁蛋白受体1（TFR-1，TFRC）转运蛋白进入细胞，并由细胞金属还原酶STEAP3还原为二价铁离子（Fe²⁺）。Fe²⁺通过二价金属转运蛋白1（DMT1）转运到细胞质中，参与DNA合成和氧气运输，并调节代谢途径。过量的Fe²⁺在细胞质中积累，通过芬顿反应产生ROS（主要是羟基自由基），从而导致膜脂质过氧化和铁死亡（Chen等人，2020）。

氨基酸代谢也对铁死亡有调节作用，其中谷胱甘肽（GSH）作为GPX4的底物（Zheng和Guan，2023）。抗氧化剂GPX4可抑制Fe²⁺依赖性的有毒脂质ROS的形成（Forcina和Dixon，2019）。在细胞膜上，溶质载体家族7的成员11（SLC7A11）与溶质载体家族3的成员2（SLC3A2）共同形成半胱氨酸/谷氨酸反向转运系统xc-，该系统将外源性半胱氨酸转运到细胞内以换取谷氨酸（Li等人，2022）。SLC7A11主要负责大多数哺乳动物细胞中的半胱氨酸摄取，而谷氨酸的转运则由SLC3A2完成。摄入的半胱氨酸在谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）和谷胱甘肽（GSS）的帮助下生成GSH（Zheng和Guan，2023）。此外，甲硫氨酸可以通过转硫化途径生成半胱氨酸（Ursini等人，1982）。因此，GPX4和xc-系统在与铁死亡相关的氨基酸代谢中起着关键作用。GPX4的辅酶GSH可将磷脂过氧化物转化为磷脂，从而保护细胞免受铁死亡的影响（Ursini等人，1982）。此外，半胱氨酸-谷氨酸转运蛋白或GPX4的抑制会导致GSH耗竭，进而激活铁死亡（Miyauchi等人，2024）。

铁死亡在神经退行性疾病中的作用已被证实，研究表明GPX4对抑制铁死亡对于运动神经元的健康和存活至关重要（Chen等人，2015；Do Van等人，2016）。线粒体脑肌病、乳酸酸中毒和中风样发作（MELAS）是一种线粒体疾病，其特征是呼吸功能受损、ATP生成不足以及急性发作时无氧糖酵解加剧导致乳酸水平升高。MELAS主要影响神经系统和肌肉系统，患者（通常是儿童或年轻人）会出现反复发作的脑病、肌肉无力、头痛和局部神经功能障碍。mtRNA^{Leu (UUR)}（MTTL1）基因中的A3243G突变占MELAS病例的80%以上（Yasukawa等人，2020；Ikeda等人，2018；Lin等人，2019）。我们从一名MELAS患者身上分离出两种成纤维细胞系（分别携带低和高水平的线粒体DNA突变，称为MELAS^Low和MELAS^Hi细胞）。研究表明，线粒体功能障碍和相关氧化应激通常会增加对线粒体依赖性凋亡的敏感性，尤其是在应激条件下（Hamacher-Brady和Brady，2016）。在基线条件下，MELAS^Hi细胞中观察不到内在的凋亡途径，这可能是由于高mtDNA突变率和更严重的线粒体功能障碍，导致TUNEL染色结果较低（Lin等人，2024）。这提示可能存在其他程序性细胞死亡途径，因此我们研究了罗藤酮处理后的MELAS成纤维细胞中是否会发生铁死亡。

目前，MELAS患者的治疗选择有限，主要是支持性疗法，如辅酶Q10、烟酰胺和L-肉碱，这些疗法可能有助于改善线粒体功能或提供抗氧化作用（Hajihashemi等人，2019），但尚未找到能够阻止MELAS进展的治疗方法。因此，我们试图证明罗藤酮处理会在MELAS患者来源的成纤维细胞模型中诱导铁死亡，并探索潜在的策略来缓解线粒体功能障碍相关疾病。

章节片段

人皮肤成纤维细胞的分离和培养

在之前的研究中，我们建立了人MELAS成纤维细胞原代培养系（Lin等人，2019），并记录了原始供体信息。这些成纤维细胞系来自台湾高雄长庚纪念医院（CGMH）进行的皮肤活检，已获得伦理委员会（IRB）的批准（IRB编号：201406985A3C502）。MELAS^Hi和MELAS^Low成纤维细胞系分别来自从患者侧面取出的3毫米活检样本。

罗藤酮诱导的复合体I抑制会降低MELAS成纤维细胞的存活率并加剧氧化应激

携带不同线粒体DNA（mtDNA）突变的MELAS患者来源的原始成纤维细胞克隆被分为MELAS^Low和MELAS^Hi细胞系，并对其细胞和线粒体功能进行了分析。MELAS^Hi细胞系的mtDNA突变率显著高于MELAS^Low组（图1A，1B），表明其线粒体功能障碍更为严重。为了研究线粒体应激反应，我们使用了罗藤酮（一种复合体I抑制剂）。

结论与讨论

为了探讨MELAS成纤维细胞中铁死亡的诱导机制，我们用复合体I抑制剂罗藤酮处理了MELAS^Low和MELAS^Hi成纤维细胞。罗藤酮引发了多种铁死亡特征，包括细胞存活率显著下降（通过细胞计数实验测定，图1C）。氧化损伤明显增加，细胞（CM-H₂DCFDA染色，图2A）和线粒体中的ROS水平也升高。

资助声明

本研究得到了台湾科技部（资助编号：NSTC 112–2314-B-182A-086-MY3；NSTC 113–2314-B-182A-042；NSTC 114–2314-B-182A-012）和高雄长庚纪念医院（资助编号：CMRPG8M1111）的财政支持。

未引用参考文献

(Lin等人，2015)

CRediT作者贡献声明

林宇涵：软件、方法学、实验设计、数据分析。王晓文：方法学、实验设计、数据分析。李宇安：软件、方法学、实验设计、数据分析。陈婷雅：软件、方法学、实验设计。连伟雄：资源支持、方法学、数据管理。王凤生：资源支持、数据管理。兰敏瑜：数据可视化。刘家伟：指导、方法学、数据分析。林祖恭：撰写、审稿与编辑、指导。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢研究助理王晓文在实验中的协助，感谢林宇涵博士撰写手稿，以及林祖恭博士对手稿的校对。作者还要感谢转化医学研究所提供的OlympusFV1000共聚焦显微镜用于获取共聚焦图像，以及BioSpectrum? 600成像系统?用于检测蛋白质表达。同时感谢技术支持人员提供的帮助。