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本研究发现，去泛素化酶OTUD4在胰腺导管腺癌（PAAD）中高表达，通过直接结合YAP蛋白并降低其K48连接的多聚泛素化水平，从而稳定YAP蛋白并增强Hippo/YAP信号通路的活性，最终促进PAAD的增殖、侵袭等恶性表型。敲低OTUD4能显著抑制肿瘤生长，靶向OTUD4可能成为PAAD治疗的新策略。这一发现揭示了泛素化修饰在Hippo通路调控及胰腺癌进展中的新机制，为临床治疗提供了潜在靶点。
胰腺癌因其极高的死亡率被誉为“癌中之王”，患者整体五年生存率通常不足10%。尽管其凶险，科学家们仍在不断探索其背后复杂的分子机制，以期找到新的突破口。其中，Hippo信号通路在控制器官大小和抑制肿瘤发生中扮演着“总开关”般的核心角色，而通路的关键效应分子YAP（Yes-Associated Protein）一旦“失控”过度激活，便会强力驱动多种癌症的发生与发展。在胰腺癌中，人们已观察到Hippo/YAP轴的异常活化，但其具体的调控网络，尤其是蛋白翻译后修饰如何精细调节YAP的“生命”（稳定性），仍有许多未解之谜。这就像我们知道一台机器（YAP）在癌症车间里疯狂运转，却不完全清楚是谁在持续给它加油（稳定它），阻止它被送去报废（降解）。
针对这一科学难题，来自中国医科大学附属盛京医院的研究团队在《Neoplasia》上发表了一项重要研究。他们如同侦探一般，通过生物信息学分析结合功能性筛选，锁定了一个名为OTUD4（OTU Domain-Containing Protein 4）的去泛素化酶。研究表明，OTUD4就是那个在胰腺癌中为YAP“保驾护航”的关键分子。它不仅与YAP表达呈正相关，其高表达还预示着患者更差的预后。当研究人员在细胞和动物模型中“关闭”OTUD4后，胰腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力被显著遏制，肿瘤生长也受到强力抑制。其背后的分子机制是，OTUD4能够像“钥匙”一样，通过其OTU结构域“插入”YAP的WW结构域，形成稳定的复合物。更重要的是，作为去泛素化酶，OTUD4利用其水解活性，特异性地“清除”掉标记在YAP蛋白上、旨在将其送往蛋白酶体降解的K48连接型泛素链。这一操作直接延长了YAP的“寿命”，稳定了其蛋白水平，使得更多的YAP能够进入细胞核，与转录因子TEAD合作，启动下游如CTGF、CYR61等促癌基因的转录，最终推动胰腺癌的恶性进展。这项研究首次揭示了OTUD4通过去泛素化稳定YAP进而激活Hippo/YAP轴促进胰腺癌进展的全新机制，不仅深化了对胰腺癌发病机理的理解，也为开发以OTUD4为靶点的新型抗癌疗法提供了坚实的理论依据。
为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。在临床数据分析方面，研究利用了TCGA-PAAD和GTEx数据库进行生物信息学挖掘与生存分析，并收集了本院的人体胰腺癌与癌旁组织样本进行免疫组化验证。在机制探索层面，核心技术包括：1) 基因集富集分析（GSEA）与siRNA文库筛选，以发现调控Hippo通路的关键去泛素化酶；2) 双荧光素酶报告基因检测，用于评估TEAD的转录活性；3) 蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）和免疫荧光（IF），以验证OTUD4与YAP的相互作用及亚细胞定位；4) 泛素化分析实验，明确OTUD4对YAP泛素化修饰类型（K48/K63连接）的影响；5) 蛋白质稳定性实验（使用环己酰亚胺CHX），检测OTUD4对YAP蛋白半衰期的影响；6) 体内功能验证，通过构建裸鼠皮下移植瘤模型，观察OTUD4敲低对肿瘤生长的抑制作用。
研究结果
OTUD4 regulates the Hippo pathway in PAAD (OTUD4调控PAAD中的Hippo通路)
研究人员通过GSEA分析和siRNA筛选，发现敲低OTUD4能最显著地抑制TEAD的转录活性。生物信息学分析显示，OTUD4的高表达与YAP基因特征集呈强正相关，且与患者不良预后相关。在胰腺癌组织中，OTUD4的表达显著高于正常组织，且其表达水平与YAP呈正相关。敲低OTUD4后，RNA测序及GSEA分析证实YAP靶基因的表达显著下调。这些结果表明OTUD4是Hippo通路的重要调节因子。
OTUD4 is crucial for the progression of PAAD (OTUD4对PAAD的进展至关重要)
在细胞水平，敲低OTUD4显著抑制了胰腺癌细胞系（AsPC-1和SW1990）的增殖、迁移、侵袭能力，并促进了细胞凋亡。在动物水平，构建的裸鼠皮下移植瘤模型显示，敲低OTUD4能显著降低肿瘤的重量和生长速度，并减少肿瘤组织中增殖标志物Ki-67阳性细胞的比例。这些发现证明了OTUD4对胰腺癌进展具有不可或缺的作用。
The hydrolytic activity of OTUD4 is essential in regulating YAP function (OTUD4的水解活性对调节YAP功能至关重要)
OTUD4属于OTU家族的去泛素化酶（DUB）。研究构建了其催化活性丧失的突变体（C45A）。实验发现，敲低OTUD4会降低YAP蛋白水平及其靶基因CTGF、CYR61的表达，并抑制TEAD活性；而过表达野生型OTUD4则产生相反效果。然而，过表达催化失活的C45A突变体则无法产生这些效应。这说明OTUD4是通过其去泛素化酶活性来调控YAP功能的。
YAP overexpression rescues OTUD4 knockdown-induced suppression of PAAD (YAP过表达可挽救OTUD4敲低导致的PAAD抑制)
为了确认OTUD4的作用是否通过YAP介导，研究人员进行了回复实验。在敲低OTUD4的同时过表达YAP，可以逆转因OTUD4缺失导致的YAP蛋白水平下降、靶基因表达下调、细胞增殖/侵袭/迁移受抑制以及细胞凋亡增加等表型。在动物实验中，YAP过表达同样能够恢复因OTUD4敲低而被抑制的肿瘤生长。这证明OTUD4的促癌效应主要是通过稳定并激活YAP来实现的。
OTUD4 interacts with YAP to promote its stability (OTUD4与YAP相互作用以促进其稳定性)
机制研究表明，OTUD4与YAP存在内源性相互作用。通过结构域映射，发现OTUD4的OTU结构域与YAP的WW结构域是二者结合的关键。免疫荧光显示OTUD4主要位于细胞质。进一步实验发现，敲低OTUD4会缩短YAP蛋白的半衰期，而这种效应可被蛋白酶体抑制剂MG132所消除。过表达野生型OTUD4能延长YAP的半衰期，但C45A突变体则不能。这表明OTUD4是通过蛋白酶体途径来稳定YAP蛋白的。
OTUD4 stabilizes YAP via decreasing its K48-linked polyubiquitination (OTUD4通过降低YAP的K48连接多聚泛素化来稳定它)
最关键的机制揭示在于泛素化分析。研究表明，敲低OTUD4会特异性地增加YAP的K48连接型多聚泛素化水平，而对K63连接型没有明显影响。相反，过表达野生型OTUD4则会降低YAP的K48连接型多聚泛素化。催化失活的C45A突变体则失去了这种调节能力。因此，OTUD4是通过其去泛素化酶活性，特异性去除YAP蛋白上的K48连接泛素链，从而阻止其被蛋白酶体降解，最终达到稳定YAP、激活下游转录的目的。
研究结论与意义
本研究系统性地揭示了一条全新的胰腺癌进展调控轴：OTUD4-YAP-Hippo。研究结论指出，在胰腺导管腺癌中高表达的OTUD4，通过其OTU结构域与YAP的WW结构域直接结合，并利用其去泛素化酶活性，特异性地削减YAP蛋白上的K48连接型多聚泛素化修饰。这一操作如同去除了YAP的“降解标签”，显著增强了YAP的蛋白稳定性，导致更多的YAP入核并与TEAD转录因子结合，进而驱动CTGF、CYR61等下游促癌基因的转录表达，最终加速胰腺癌的增殖、侵袭和转移等恶性进程。
这一发现具有多重重要意义。在理论层面，它首次将去泛素化酶OTUD4与经典的Hippo/YAP信号轴联系起来，拓宽了人们对Hippo通路翻译后修饰调控方式的认识，为理解胰腺癌中YAP异常活化的原因提供了新的分子视角。在转化医学层面，研究证实敲低OTUD4能有效抑制胰腺癌进展，且其促癌功能高度依赖于对YAP的稳定作用。鉴于YAP本身作为转录因子难以直接靶向，OTUD4作为一个酶学靶点，为开发针对Hippo通路的新型治疗策略提供了极具潜力的方向。尽管目前尚缺乏OTUD4的特异性抑制剂，且OTUD4在其他癌症中可能扮演抑癌角色（如稳定p53），但考虑到胰腺癌中p53高频突变的背景，靶向OTUD4可能具有较好的特异性和安全性。未来，借助高通量化合物筛选或PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）等新兴技术，有望开发出有效的OTUD4抑制剂，为攻克胰腺癌这一顽疾增添新的武器。
