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本研究针对与胃癌风险相关的咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）等九种TMPC（Treponema pallidum membrane protein C）阳性链球菌，通过免疫信息学方法筛选出B细胞、CTL（Cytotoxic T Lymphocyte）及HTL（Helper T Lymphocyte）表位，并整合TLR（Toll-Like Receptor）激动剂等佐剂，成功构建了两种多表位疫苗。借助分子对接、分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟及计算机免疫模拟，研究证实了疫苗与关键免疫受体（HLA-A*02:01、HLA-DRB1 * 01:01、TLR2、TLR4）的稳定结合及激发强大免疫应答的潜力，为开发基于mRNA（messenger RNA）技术、旨在降低由特定口腔链球菌群（SAG）感染所致胃癌风险的新型预防策略提供了重要的计算依据。
胃癌是全球第五大常见癌症，其发生与幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）感染密切相关。然而，部分胃癌患者幽门螺杆菌检测为阴性，研究表明其胃黏膜富集了包括咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）在内的多种口腔病原体。咽峡炎链球菌是一种革兰阳性球菌，具有耐酸性，可能通过其表面蛋白TMPC（Treponema pallidum membrane protein C）与胃上皮细胞的膜联蛋白A2（ANXA2）受体相互作用，激活MAPK（Mitogen-Activated Protein Kinase）信号通路，从而促进其定植、侵袭并参与胃癌的发生发展。除咽峡炎链球菌外，在胃癌富集的微生物群中还鉴定出另外八种同样高表达TMPC的链球菌属物种，它们同属于咽峡炎链球菌群（SAG），这些菌株也可能通过TMPC相关途径促进疾病的发生与进展。
鉴于针对这些细菌感染的抗生素治疗存在耐药性增加的风险，开发一种有效的疫苗成为控制病原体、预防由长期定植引发胃癌的潜在策略。为此，研究人员设计了一种靶向九种TMPC阳性链球菌（以咽峡炎链球菌为主）TMPC蛋白的多表位信使RNA（mRNA）疫苗，并利用一系列计算生物学方法对其进行了全面评估。
1 表位鉴定
研究首先从NCBI数据库获取了九种链球菌的TMPC蛋白参考序列。通过NetMHCpan4.1、IEDB（Immune Epitope Database）等服务器预测并筛选了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位、辅助性T淋巴细胞（HTL）表位和线性B淋巴细胞（LBL）表位。筛选标准包括与主要组织相容性复合体（MHC）分子的高结合亲和力、良好的抗原性、免疫原性、安全性（无过敏性和毒性）以及诱导干扰素-γ（IFN-γ）的能力。最终，确定了9个CTL表位、15个HTL表位和12个B细胞表位用于疫苗构建。
2 保守性分析与多重序列比对
利用MEGA11软件对来自24种潜在致病性链球菌的TMPC蛋白序列进行系统发育树构建和多重序列比对。热图分析显示，大多数选定的CTL、HTL和B细胞表位在菌株间高度保守，部分位点存在菌株特异性的缺失或变异。这确保了疫苗可能对多种TMPC阳性链球菌产生交叉保护作用。
3 T细胞表位与MHC分子的对接
通过PEP-FOLD3服务生成T细胞表位的三维结构，并从PDB（Protein Data Bank）数据库或利用SWISS-MODEL服务器获取MHC-I和MHC-II分子的三维结构。使用ClusPro 2.0服务器进行分子对接，并用PRODIGY（PROtein binDIng enerGY prediction）工具计算结合自由能。结果显示，CTL表位与MHC-I等位基因的结合能为-10.4至-7.7 kcal/mol，HTL表位与MHC-II等位基因的结合能为-10至-7.4 kcal/mol，表明这些表位与MHC分子具有较强的结合亲和力。PyMOL软件可视化及LigPlot+分析进一步揭示了表位与MHC分子之间的关键相互作用氢键和疏水作用。
4 多表位疫苗的构建
为了增强免疫激活，研究构建了两种不同的疫苗结构。两种疫苗均包含了筛选出的所有表位，并在N端加入了TLR2激动剂作为佐剂（疫苗1使用人β-防御素3（hBD-3），疫苗2使用胸腺五肽（TP5）），在C端加入了TLR4激动剂RS09。表位之间通过特异性连接子连接：CTL表位间使用AAY连接子，HTL表位间使用GPGPG连接子，B细胞表位间使用KK连接子。此外，还加入了泛HLA-DR相关表位（PADRE）以激活广泛的CD4
+T细胞辅助，并在C端添加了6xHis标签以便纯化。
5 疫苗的理化性质、抗原性及结构预测
利用ProtParam、VaxiJen 2.0、AllerTOP 2.0和ToxinPred 2.0等工具评估了疫苗的理化性质、抗原性、过敏性和毒性。两种疫苗均被预测为抗原性良好、无过敏性和无毒性的稳定蛋白。使用PSIPRED 4.0预测二级结构显示，疫苗以无规卷曲和α-螺旋为主。利用Chai 1和AlphaFold2预测三级结构，并通过GalaxyRefine服务器进行优化。优化后的模型经Ramachandran图、ERRAT评分、ProSA Z评分和Verify3D验证，显示出良好的立体化学质量和结构可靠性。
6 不连续B细胞表位预测与疫苗-受体分子对接
使用ElliPro工具预测了疫苗三维结构中的不连续B细胞表位，两种疫苗均被预测存在多个潜在的构象表位，表明其有望引发有效的体液免疫应答。随后，将疫苗与关键免疫受体——Toll样受体2和4（TLR2/TLR4）以及人类白细胞抗原HLA-A*02:01和HLA-DRB1 * 01:01进行分子对接。ClusPro和HADDOCK的对接结果表明，两种疫苗均能与这些受体稳定结合，形成多个氢键和盐桥。与已知的TLR结合蛋白（如PepO和溶血素）的比较显示，设计的疫苗具有相当的结合强度。
7 分子动力学（MD）模拟
对疫苗-受体复合物进行了100 ns的分子动力学模拟，以评估其结合稳定性和动态行为。通过分析均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）和氢键数量等参数发现，疫苗2与受体复合物的RMSD波动更小，更快达到平衡，且整体结构更紧凑，显示出优于疫苗1的结构稳定性。氢键分析表明疫苗2与HLA分子形成了更多的氢键，提示更强的相互作用。
8 结合自由能计算（MM-PBSA）
基于MD轨迹的MM-PBSA（分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积）计算进一步量化了结合自由能。结果显示，疫苗2与所有受体的总结合自由能均显著优于疫苗1，尤其是在与HLA-DRB1 * 01:01和TLR4的结合中表现出更强的亲和力，这主要归功于其更有利的范德华相互作用贡献。
9 免疫模拟与人群覆盖率分析
使用C-IMMSIM服务器进行计算机免疫模拟。模拟结果显示，接种这两种疫苗（三次注射）后，可诱发强烈的体液和细胞免疫应答。具体表现为B细胞数量增加，免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）抗体水平显著升高，记忆B细胞和辅助性T细胞（TH）数量增多并长期维持，同时诱导产生高水平的IFN-γ、白细胞介素-2（IL-2）、IL-4等多种细胞因子。与对照疫苗ZnuA101相比，疫苗2诱导的免疫应答更强烈、更持久。此外，基于所选表位对应MHC等位基因的人群覆盖率分析表明，该疫苗在全球范围内具有高达95.67%的理论覆盖率，在大多数地区超过99%。
10 mRNA疫苗前体的构建
最后，研究将优化的疫苗蛋白序列反向翻译为DNA序列，并进行了密码子优化，获得了理想的密码子适应指数（CAI）和GC含量。随后，在序列中添加了Kozak序列、组织纤溶酶原激活物（tPA）信号肽、MHC-I靶向结构域（MITD）等元件以增强mRNA的稳定性、翻译效率和抗原提呈。RNAfold预测的mRNA二级结构显示其具有较低的折叠自由能，表明结构稳定。最终，将疫苗序列克隆至pET-28a (+)表达载体中，完成了mRNA疫苗的设计。
4 讨论
本研究针对与胃癌发生相关的咽峡炎链球菌群，通过系统的计算生物学流程，成功设计了两种基于TMPC蛋白的多表位mRNA疫苗候选物。综合表位筛选、保守性分析、分子对接、分子动力学模拟、免疫模拟等一系列评估，证实了这两种疫苗（尤其是疫苗2）具有良好的抗原性、安全性、与关键免疫受体的稳定结合能力以及激发强大且持久免疫应答的潜力。该研究为开发针对SAG感染相关胃癌的新型预防性疫苗提供了重要的前期理论依据和设计蓝图。然而，这些积极的计算机预测结果仍需后续的体外和体内实验（如动物研究）来进一步验证其免疫原性和实际保护效力。
