《Molecular Plant Pathology》：Genome-Edited Maize Expressing Two Native Genes Confers Broad-Spectrum Resistance to Northern Corn Leaf Blight
编辑推荐：
本文通过CRISPR-Cas9技术精准置换玉米NLB18-R抗病基因并叠加HT1-R基因，构建了可抵御多种病原菌小种的广谱抗性植株，为作物抗病育种提供了突破性方案（NCLB：北方玉米叶枯病）。该研究证实基因编辑可避免传统回交育种的连锁累赘，且不影响产量。
北方玉米叶枯病（NCLB）是由病原真菌Setosphaeria turcica引起的毁灭性病害，可导致玉米减产高达50%。传统抗病育种依赖回交导入抗性基因，但存在连锁累赘和耗时过长（6-7个回交世代）的瓶颈。本研究创新性地运用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，在玉米中实现双重抗病基因的精准整合与叠加，为作物抗病育种开辟了新路径。
抗病基因鉴定与功能验证
研究团队从抗病自交系PH26N中鉴定出NLB18-R基因，该基因与已知Htn1/Ht2/Ht3抗性位点等位，编码一种细胞壁相关激酶。通过转基因过表达实验证实，NLB18-R可显著增强玉米对S. turcica 0号小种的抗性。转基因植株在田间试验中表现出高抗病性（抗性评分8-9分），而对照植株则完全感病。
CRISPR-Cas9介导的等位基因置换
针对传统育种中连锁累赘问题，研究设计了"两步法"基因编辑策略：首先利用双gRNA（gRNA#1/gRNA#2）删除感病等位基因NLB18-S，随后在新生DNA断裂位点精准插入13.6 kb的NLB18-R抗病基因。优化后的方案将同源定向修复（HDR）效率提升至1.4%，成功获得完全去除外源DNA的纯合编辑植株。该技术突破实现抗病基因"无缝"置换，彻底避免连锁累赘。
靶向基因叠加与复合性状位点构建
为应对病原菌多小种威胁，研究团队在玉米1号染色体预选位点（TS45/TS10）分别插入NLB18-R和HT1-R基因。通过遗传杂交将两基因重组至44 kb区间，形成复合性状位点（CTL）。重组频率（0.52%）符合预期，成功获得双基因纯合植株。基因表达分析显示，外源插入基因在非原生位点仍保持正常表达水平。
广谱抗病性验证
温室与田间试验证实，NLB18-R单基因植株可抵抗0号和1号病原菌小种，HT1-R单基因植株对0号和23N小种有效，而双基因叠加植株对0/1/23N三种小种均表现出完全抗性。在混合小种接种试验中，叠加植株抗性评分显著高于对照组（p<0.05），且病斑完全抑制。
产量安全性评估
多年度多地点（21个试验点）田间试验表明，在无病害压力条件下，基因编辑杂交种与对照组的产量无显著差异（p>0.05）。NLB18-R、HT1-R及双基因叠加植株的百粒重、籽粒含水量等农艺性状均与野生型相当，证实抗病基因精准插入未引发产量损失。
本研究首次实现玉米大片段抗病基因（13.6 kb）的精准置换与多基因叠加，为作物抗病育种提供三大创新：一是通过CRISPR-Cas9技术彻底规避连锁累赘；二是构建复合性状位点实现多基因协同表达；三是证实抗病基因精准编辑不影响产量。该技术体系为玉米及其他作物的广谱抗病育种提供了可推广的范式。
