苯甲酸钠对小鼠因甲苯引起的奖赏增强、行为紊乱以及突触可塑性损伤的保护作用

《NeuroToxicology》：Protective effects of sodium benzoate against toluene-induced reward enhancement, behavioral disturbances, and impaired synaptic plasticity in mice

甲苯通过抑制NMDAR导致神经行为异常和突触功能障碍，钠苯甲酸作为DAAO抑制剂可增强NMDAR功能，改善甲苯中毒引起的ICSS阈值降低、运动失调、记忆缺陷及海马突触可塑性受损。

　　

谢忠平|李美仪|林佳宇|陈明焕|陈慧贤

台湾苗栗县竹南市基安路35号，国家卫生研究院神经精神病学研究中心

摘要

甲苯是最常被滥用的溶剂之一。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）的抑制与甲苯的奖赏效应和行为效应有关。增强NMDAR功能的一种方法是通过抑制D-氨基酸氧化酶（DAAO）的活性来增加D-丝氨酸的水平。本研究旨在探讨苯甲酸钠（一种DAAO抑制剂）是否能够对抗急性甲苯暴露后引起的脑刺激奖赏增强、行为障碍以及海马体突触功能障碍。雄性小鼠在甲苯暴露前接受了不同剂量的苯甲酸钠，以评估其颅内自我刺激（ICSS）阈值、旋转棒测试、新物体识别任务以及海马体突触传递的长时增强（LTP）和长时抑制（LTD）情况。苯甲酸钠防止了甲苯导致的ICSS阈值降低、运动协调障碍、社交退缩、物体识别记忆缺陷以及LTP和LTD的受损。这些结果表明，苯甲酸钠可以缓解甲苯引起的脑奖赏功能增强、行为障碍和突触可塑性损伤，提示它可能是一种有前景的化合物，可用于治疗意外或故意吸入导致的急性甲苯中毒。

引言

甲苯是一种广泛使用的工业溶剂，无论是意外接触还是故意吸入，都会产生协调障碍、平衡失调、意识混乱和记忆丧失等症状（Anderson和Loomis，2003；Chouaniere等人，2002；Saito和Wada，1993）。多项啮齿动物研究表明，甲苯暴露后会出现运动协调障碍、认知缺陷和社交退缩（Chan等人，2015；Hsieh等人，2020）。甲苯的许多急性效应被认为是由N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）功能低下引起的，因为甲苯在体外会抑制NMDAR的活性（Cruz等人，1998）。其行为特征——包括双相运动反应（Chan等人，2004；Riegel等人，2004；Riegel和French，1999）、共济失调（Brahmachari等人，2009）以及认知障碍（Huerta-Rivas等人，2012；Lo等人，2009；Win-Shwe和Fujimaki，2012）——与NMDAR拮抗剂引起的症状非常相似。

由于甲苯具有致欣快感和致幻作用，其娱乐性使用（Garland和Howard，2010）在青少年中尤为普遍。与苯环利定（PCP）（Carlezon和Wise，1993）和MK-801（Herberg和Rose，1989）类似，甲苯能够以剂量依赖的方式降低大鼠（Bespalov等人，2003）和小鼠（Chan等人，2012a，2012b，2015）的颅内自我刺激（ICSS）奖赏阈值。这种ICSS阈值的降低反映了大脑奖赏敏感性的增强，这一过程会促进药物寻求和成瘾行为。这些物质对大脑奖赏回路的共同促进作用表明，NMDAR功能低下可能是它们滥用潜力的共同机制。

急性甲苯暴露会导致特定区域和细胞类型的神经活动及突触传递紊乱，这被认为是其多种行为效应的基础（Beckley等人，2013；Braunscheidel等人，2024；Hsieh等人，2020；Okas等人，2023；Wayman和Woodward，2018）。例如，甲苯会增强中边缘多巴胺神经元的突触传递，这与它的奖赏特性相关（Beckley等人，2013）；而它对海马体突触传递和可塑性的抑制——包括长时增强（LTP）——则与认知障碍有关（Hsieh等人，2020）。

研究表明，增强NMDAR共激动剂位点的活性可以减轻甲苯的多种神经行为效应。例如，二甲基甘氨酸和肌氨酸已被研究用于对抗甲苯暴露的损害。二甲基甘氨酸可以防止甲苯引起的记忆缺陷和突触功能及可塑性损伤（Hsieh等人，2020）。肌氨酸（一种甘氨酸转运蛋白抑制剂和甘氨酸位点激动剂）可以逆转甲苯引起的过度活跃、运动协调障碍和记忆缺陷，尽管它不能阻断甲苯对脑刺激奖赏的增强作用（Chan等人，2012a，2012b）。

D-丝氨酸是主要的天然NMDAR共激动剂，对伏隔核的突触可塑性和药物奖赏处理至关重要（D'Ascenzo等人，2014；Liu等人，2016）。尽管高剂量D-丝氨酸（约1000 mg/kg）可以缓解甲苯引起的行为缺陷（Brahmachari等人，2009），但其较差的脑渗透性和肾毒性风险（Williams等人，2005）限制了其治疗潜力。一种更可行的方法是通过抑制D-氨基酸氧化酶（DAAO）来增强内源性D-丝氨酸，DAAO是负责其降解的主要酶。抑制DAAO可以有针对性地恢复NMDAR功能，并对抗甲苯引起的奖赏效应和行为障碍。因此，我们选择了苯甲酸钠这种中等效力的DAAO抑制剂，因为它具有优异的安全性，以测试其是否能够减少甲苯的奖赏效应并防止相关的行为和突触损伤。

虽然人类通常通过吸入方式接触甲苯，但在啮齿动物中腹腔注射（i.p.）可以可靠地再现吸入甲苯所产生的行为效应。值得注意的是，560 mg/kg的甲苯腹腔注射可以在用6000 ppm甲苯蒸汽训练10分钟后引发99%的杠杆反应（Shelton和Slavova-Hernandez，2009）。无论是吸入还是腹腔注射途径，导致完全替代的血甲苯浓度几乎相同，进一步支持了腹腔注射剂量的转化相关性。本研究中使用的剂量（500和750 mg/kg，i.p.）预计会产生与暴露于6000–8000 ppm蒸汽10分钟后相当的内感受刺激效应和血甲苯浓度。作为参考，人类职业接触甲苯的限值为500 ppm（10分钟峰值），而娱乐性滥用通常涉及在短时间内（10–15分钟）吸入高浓度溶剂（通常几千ppm）。

基于这一成熟的腹腔甲苯暴露模型，并使用一系列行为和电生理学检测方法，我们研究了苯甲酸钠是否能够减弱甲苯引起的脑刺激奖赏增强效应（通过ICSS阈值来衡量），并改善运动协调、社交互动、物体识别以及海马体突触传递和可塑性方面的缺陷。海马体突触传递通过输入/输出（I/O）曲线进行评估，同时并行评估了长时增强（LTP）和长时抑制（LTD）这两种与物体识别记忆密切相关的突触可塑性形式（Goh和Manahan-Vaughan，2013）。

苯甲酸钠是一种获得FDA批准的低成本化合物，临床上用于治疗高氨血症。最近的一项I期开放标签试验进一步证明了其良好的安全性和耐受性（Lin等人，2022）。此外，越来越多的证据表明苯甲酸钠具有提高认知能力（Liang等人，2024）、抗氧化和抗炎作用（Brahmachari等人，2009）。然而，长期暴露于高剂量苯甲酸钠（200–700 mg/kg，持续30天）会导致运动障碍、氧化应激、神经炎症和细胞毒性（Khan等人，2022）。因此，本研究中还包括了一个单独接受苯甲酸钠（300 mg/kg）的实验组，以确认用于对抗急性甲苯效应的剂量不会产生不良后果。

章节片段

ARRIVE声明

所有动物实验均遵循ARRIVE 2.0指南进行。实验使用了5只C57BL/6J雄性小鼠（Jackson Laboratories，加利福尼亚州萨克拉门托）。小鼠在12小时明暗周期下单独饲养，手术后可自由摄取食物和水。所有操作均在加州大学圣地亚哥分校的黑暗时段（10:00-14:00）进行，符合美国动物实验协会的指南。

苯甲酸钠对甲苯诱导的ICSS阈值降低的影响

根据拉丁方设计，给小鼠分别注射甲苯、玉米油（溶剂）和苯甲酸钠（0、100和300 mg/kg）。双向重复测量方差分析显示，甲苯对ICSS阈值降低有显著的主效应（F_1,8 = 79.398，p < 0.001），但苯甲酸钠没有显著的主效应（F_2,8 = 1.726，p = 0.238），甲苯与苯甲酸钠之间的交互作用也没有显著效应（F_2,8 = 1.612，p = 0.258）。反应潜伏期未受到甲苯的影响（F_1,8 = 0.928，p = 0.390）。

讨论

与先前的研究一致，腹腔注射甲苯会导致小鼠出现一系列行为障碍，包括运动协调障碍、识别记忆缺陷和社交退缩（Chan等人，2012a，2012b，2015；Hsieh等人，2020；Wu等人，2018），并降低了ICSS阈值。此外，甲苯通过使I-O曲线变平来抑制突触传递，并破坏了海马体CA3-CA1区域的LTP（Hsieh等人，2020）。

CRediT作者贡献声明

陈慧贤：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。李美仪：撰写——审稿与编辑、方法学、研究、数据管理、概念化。谢忠平：撰写——初稿、研究、数据管理。陈明焕：撰写——审稿与编辑、方法学、概念化。林佳宇：撰写——审稿与编辑、研究、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了台湾国家科学技术委员会（资助编号NSC 99-2314-B-400-005-MY3）、国家卫生研究院（资助编号NP-103-PP-02）以及国家药物滥用研究所颁发的杰出国际科学家合作奖（授予H-HC，2010年）的支持。

在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来纠正语法错误。使用该工具/服务后，作者根据需要进行内容的审查和编辑。