编辑推荐：
本篇研究系统探讨了牙髓间充质干细胞（DP-MSC）来源的外泌体（Exosomes）与叶酸（FA）在体外牙周损伤模型中的协同调控作用。研究证实，DP-MSC-Exos能显著下调凋亡（Bax/Bcl2）、抗氧化（SOD, CAT, GPx）及炎症（TGF-β, IL-6）相关基因的表达，而FA则特异性抑制TNF-α。两者联用可最大程度恢复损伤的人牙龈成纤维细胞（hGFs）形态。这些发现为开发无细胞的、基于外泌体的牙周再生疗法提供了新的实验依据，展现出优于传统细胞疗法的潜力。
1 引言
牙周炎是一种高发的炎症性疾病，是全球第六大常见病症，会导致牙周组织（包括牙周韧带、牙骨质和牙槽骨）不可逆的破坏，最终导致牙齿脱落。当前的牙周治疗虽能控制病情，但难以实现组织的完全再生，这构成了临床上未满足的重大需求。间充质干细胞（MSC）疗法在再生医学中展现出巨大潜力，但其临床应用受到生物安全性问题（如输注毒性、免疫反应、肿瘤风险）以及细胞生产、储存和运输等操作难题的限制。
研究表明，MSC的 therapeutic 作用很大程度上是通过分泌包括外泌体（Exosomes）在内的多种生物活性因子介导的。外泌体是尺寸在40-100纳米之间的纳米级囊泡，具有脂质双分子层膜结构，在细胞间通讯中扮演关键角色，能够递送蛋白质、核酸等生物活性 cargo 至炎症微环境。MSC来源的外泌体已被证明具有强大的免疫调节和抗炎特性，并能调控多种信号通路，在多种慢性炎症性疾病（如类风湿关节炎、骨关节炎）的治疗中展现出潜力。然而，其在牙周再生中的具体机制和疗效尚待阐明。
本研究旨在探索叶酸（FA）与来源于易于获取的牙髓间充质干细胞（DP-MSC）的外泌体，在改善体外牙周损伤模型中的作用，并重点分析它们在抗炎、抗氧化、凋亡和成骨相关关键基因表达上的调控效应。
2 材料与方法
2.1 DP-MSC的分离与培养
研究遵循《赫尔辛基宣言》，并获得了设拉子伊斯兰阿扎德大学伦理委员会的批准。从4名6-8岁健康儿童的乳牙中分离出牙髓组织，经过酶消化后，将细胞置于含20%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基中培养，在37°C、5% CO2的 humidified atmosphere 中孵育。每3天更换一次培养基，待细胞融合度达到80%时进行传代，实验使用第3代（P3）细胞。
2.2 DP-MSC的表征
通过成骨和成脂诱导分化实验对细胞进行鉴定。成骨诱导培养基添加了抗坏血酸、地塞米松和β-甘油磷酸钠，诱导20天后用茜素红染色检测钙结节。成脂诱导培养基添加了抗坏血酸、地塞米松和吲哚美辛，诱导20天后用油红O染色检测脂滴。流式细胞术分析显示，P3细胞高表达间充质干细胞标志物CD73（96.3%）和CD90（98.9%），而低表达造血标志物CD34（1.56%）和CD45（1.06%），证实了其MSC特性。相关表征结果可见于 、及 。
2.3 从DP-MSC中分离外泌体
使用第3代DP-MSC，在其融合度达到50%-60%时，更换为无血清DMEM培养基培养72小时。收集条件培养基，并使用商用Exocib试剂盒按照说明书提取外泌体，提取的外泌体储存于-70°C。
2.4 外泌体的扫描电子显微镜（SEM）分析
通过扫描电镜观察提取的外泌体形态。结果显示，外泌体呈现球形或杯状形态，尺寸在150-300纳米之间，分布均匀，表面相对光滑（见 ）。流式细胞术进一步证实，97.5%的颗粒表达外泌体表面标志物CD63，符合外泌体特征。
2.5 蛋白浓度测定（Bradford法）
采用Bradford法测定外泌体样本的蛋白浓度。以牛血清白蛋白（BSA）制作标准曲线，得出方程为y= 0.123ln(x) + 0.5059，相关系数R2= 0.9592。据此计算得出外泌体溶液的蛋白浓度为850 μg/mL（见 ）。
2.6 人牙龈成纤维细胞（hGF）培养
hGF细胞系购自伊朗德黑兰的Pasteur Institute，在DMEM-F12培养基（含10% FBS）中培养。
2.8 MTT实验
通过MTT实验评估FA、外泌体和H2O2对hGF细胞活力的影响。结果显示，2、10、20 μg/mL的外泌体处理对细胞活力无显著影响。100 μM FA能显著提高细胞活力（p= 0.0343），而50 μM和10 μM FA无显著影响。H2O2处理则呈浓度依赖性降低细胞活力，其中50 μM H2O2能显著降低活力且保留足够活细胞用于后续实验。因此，后续研究选择50 μM H2O2诱导炎症，并选用50 μM FA和20 μg/mL外泌体进行干预（见 ）。
2.9 在hGF细胞中诱导炎症
将hGF细胞接种于6孔板，用50 μM H2O2处理1小时以诱导氧化应激损伤，并用 scraper 在细胞层中央划出2 mm的划痕以模拟机械损伤。损伤后，细胞分为四组进行处理：对照组（完全培养基）、FA组（完全培养基 + 50 μM FA）、外泌体组（完全培养基 + 20 μg/mL DP-MSC-Exos）以及联合治疗组（完全培养基 + 50 μM FA + 20 μg/mL DP-MSC-Exos）。处理72小时后观察细胞形态并收集细胞进行基因表达分析。
2.10 抗炎、抗氧化、凋亡及成骨相关基因表达的测量
使用RNeasy Plus Mini Kit提取总RNA，经质量检测后合成cDNA。采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）以及受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶3（RIPK3）等基因的表达。以管家基因为内参，采用2?ΔΔCt法计算相对基因表达量。所用引物序列详见原文表1。
2.11 统计分析
数据以均值±标准差（SD）表示，所有实验均进行三次重复。使用SPSS 11.5进行统计分析。采用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性。两组比较使用非配对Student's t-检验（正态分布）或Mann–Whitney U检验（非正态分布）。多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），若存在显著差异则用Tukey's post hoc检验进行两两比较。p< 0.05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 DP-MSCs的形态
从乳牙牙髓中成功分离出MSC。培养初期细胞形态多样，包括梭形、扁平状、星形和圆形，但贴壁细胞以梭形为主。随着培养，梭形细胞增殖形成集落并逐渐融合。传代后，细胞增殖加速，约3-4天即可达到汇合状态，呈现典型的成纤维细胞样形态（见 ）。
3.7 处理后hGF细胞的形态
H2O2处理导致hGF细胞从梭形变为圆形或回缩形态，细胞铺展减少。移除H2O2后，细胞开始恢复。与单独H2O2处理组相比，FA处理组形态略有改善，外泌体处理组改善更明显。而FA与外泌体联合处理组则显示出最显著的恢复效果，细胞形态和铺展程度最接近未处理的对照组（见 ）。
3.8 基因表达分析
RT-qPCR结果显示，H2O2损伤显著上调了凋亡相关基因Bax/Bcl2比值、RIPK3，抗氧化基因SOD、CAT、GPx，以及炎症因子IL-6、TGF-β和TNF-α的表达（p< 0.01 至 p< 0.0001），但对成骨基因RUNX2的表达无显著影响。
三种治疗方案（单独外泌体、单独FA、联合治疗）均能显著逆转H2O2引起的RIPK3、SOD、CAT、GPx、TGF-β表达上调及Bax/Bcl2比值升高（p< 0.0001）。对于IL-6，三种治疗也均能显著降低其表达（外泌体组p< 0.01，FA组p< 0.001，联合组p< 0.0001）。然而，对于TNF-α，只有FA治疗能显著降低其表达（p< 0.05），而单独外泌体或联合治疗则无此效果。三种治疗方案对RUNX2的表达均无显著影响。这些结果表明，DP-MSC来源的外泌体和FA能有效调控损伤hGF细胞中与炎症、氧化应激和凋亡相关的基因表达，但在本实验条件下未影响成骨标志物RUNX2的表达（详细数据见 ）。
4 讨论
与基于细胞的MSC疗法相比，外泌体作为一种“无细胞”疗法，避免了伦理争议、免疫原性和致瘤性风险，且具有生物相容性好、能穿越生物屏障、易于存储和给药等优势。研究表明，MSC外泌体的 therapeutic 效应可能通过激活PTEN/PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、TGF-β等多种信号通路实现。本研究中观察到的TGF-β表达下调，提示外泌体的作用可能涉及这些通路的调控。
先前研究显示，负载MSC外泌体的胶原海绵在大鼠牙周缺损模型中能促进牙周再生，增强骨生长和功能性牙周韧带长度。即使外泌体在48小时内迅速释放，其促再生效果仍可持续至少4周，表明外泌体能够引发持久性的 cellular responses。本研究的体外结果与此呼应，证实了DP-MSC来源的外泌体能够快速调控关键基因表达，抑制炎症和凋亡，促进细胞形态恢复，这为外泌体在牙周再生中的应用提供了分子层面的证据。
FA作为本研究中的另一种干预物质，单独使用能特异性抑制TNF-α的表达，并与外泌体在改善细胞形态上表现出协同趋势。尽管其具体机制未在本研究中深入探讨，但FA已知的抗氧化和抗炎特性可能在此发挥了作用。
5 局限性
本研究存在一些局限性。首先，牙周损伤模型结合了氧化应激（H2O2）和机械划痕，但未设置单独的对照组来区分各自的影响。其次，尽管通过SEM和蛋白测定确认了外泌体形态和产量，并在修订中补充了CD63标志物检测，但未来研究应采用纳米颗粒追踪分析（NTA）等进行更全面的表征。第三，实验样本量较小（三个生物学重复），且未使用更高级的统计方法。第四，研究仅检测了10个基因的mRNA水平，缺乏蛋白质水平验证和功能学实验（如细胞迁移、凋亡、矿化 assay）来确认 therapeutic relevance。这些局限应在解读研究结果时予以考虑。
总结
本研究证实，牙髓间充质干细胞来源的外泌体能够有效调控体外牙周损伤模型中炎症、氧化应激和凋亡相关基因的表达。叶酸在抑制特定炎症因子（TNF-α）方面显示出独特作用。两者联用可协同促进损伤后细胞形态的恢复。这些发现为开发基于外泌体的、无细胞的牙周再生新策略提供了重要的实验依据，预示着其在克服传统干细胞疗法局限方面的广阔前景。
