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基因与顺式调控元件（CREs）间的相互作用机制尚缺乏高效解析工具。研究人员开发了结合超高效dHyperLbCas12a与RNA Pol II表达crRNA阵列的系统，实现了在原代免疫细胞与诱导多能干细胞中对CREs的高通量、多重并行激活与抑制操控。该工作为在复杂生物学系统中解析CREs的组合功能与基因调控网络提供了强大工具。
在生命科学的前沿探索中，理解基因之间以及基因与调控它们的“开关”——顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）——之间的复杂相互作用，是揭示发育、疾病等众多生物学过程核心机制的关键。传统的遗传学方法往往一次只能研究一个或少数几个基因或元件，效率低下且难以捕捉复杂的网络关系。近年来，CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律间隔成簇短回文重复序列）技术的出现，特别是其衍生工具CRISPR干扰（CRISPR interference, CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa），革命性地实现了对基因和CREs功能的高通量筛选。然而，一个突出的瓶颈依然存在：我们能够高效地分别敲低或激活成千上万个靶点，却难以系统性地探究这些靶点之间的相互作用关系，尤其是当需要同时操控多个CREs来模拟复杂的体内调控环境时。为了突破这一限制，一支研究团队开展了一项创新性工作，他们开发了一套全新的、能够实现高度多重化并行操控基因表达的系统，并将其成功应用于解析CREs的组合功能。这项重要研究成果发表在《Nature Communications》上。
为开展此项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，他们改造并优化了来源于毛螺菌科细菌（Lachnospiraceae bacterium）的Cas12a酶，获得了其超高效催化失活版本dHyperLbCas12a，作为基因编辑的“导航”核心。其次，他们创新性地利用RNA聚合酶II（RNA Polymerase II）来驱动表达超长的CRISPR RNA（crRNA）阵列，这使得单次转录能够产生包含大量不同靶向序列的crRNA混合物，从而实现高度多重化的基因靶向。最后，他们将dHyperLbCas12a与不同的转录效应结构域（如激活域或抑制域）融合，构建出功能多样的效应器，并在原代培养的免疫细胞以及诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）分化等多个具有挑战性的生物系统中进行了验证与应用。
研究结果
dHyperLbCas12a与Pol II驱动的crRNA阵列实现高效多重化操控
研究人员首先证实，与常用的dCas9系统相比，他们开发的dHyperLbCas12a效应器具有更高的靶向效率和更低的脱靶效应。更重要的是，通过使用RNA Pol II（而非传统的Pol III）来转录包含多达数十个不同靶向单元的crRNA长阵列，他们成功实现了在同一细胞群体中，对大量不同基因或CREs的同时、并行操控。这种设计突破了传统CRISPR筛选在多重性上的限制。
在原代细胞和iPSCs中验证系统的多功能性
研究团队并未满足于在易于操作的细胞系中的验证。他们将系统应用于更难转染和操作的原代免疫细胞（如T细胞）中，展示了dHyperLbCas12a系统在这些重要但脆弱的细胞类型中依然能够高效工作，实现基因的激活或抑制。此外，在iPSCs向特定细胞类型分化的过程中，利用该系统对关键转录因子进行时序性操控，证明了其在研究复杂发育过程中的潜力。
开发同时进行激活与抑制的策略
为了进一步增强系统的灵活性和模拟更真实的生物学场景，作者还开发了创新策略，使得dHyperLbCas12a能够被用于在同一实验中对不同的靶点同时实施激活和抑制。这为研究激活性和抑制性调控元件如何协同工作以精确控制基因表达网络提供了前所未有的工具。
解析CREs对基因表达的独立与组合贡献
作为系统能力的终极展示，研究人员利用dHyperLbCas12a介导的高通量CRISPRi筛选，系统地剖析了多个CREs对单个靶基因表达的贡献。他们不仅评估了每个CRE单独敲低的影响，更设计了实验来探究当两个或多个CRE被同时抑制时，其效应是简单的叠加，还是存在协同或拮抗作用。这项工作首次在高度多重化的水平上，实现了对CREs组合功能的定量解析。
研究结论与意义
本研究成功开发并验证了一套基于dHyperLbCas12a和Pol II-crRNA阵列的强大工具箱。该系统的核心优势在于其超高效和高度多重化的能力，能够轻松实现同时对数十个甚至更多基因或CREs的精确调控（激活或抑制）。这超越了现有基于dCas9的CRISPRi/a系统在多重性和效率上的局限。研究的重要意义体现在三个方面：首先，在技术层面，它提供了一种灵活、可扩展的框架，能够兼容不同的效应结构域，适用于从永生细胞系到原代细胞、干细胞等多种生物学系统，极大拓宽了CRISPR调控工具的应用范围。其次，在方法学层面，所开发的同步激活/抑制策略以及对CREs进行组合功能筛选的方法，为研究复杂的基因调控逻辑和相互作用网络建立了新的范式。最后，在生物学认知层面，这套工具使得大规模、系统性地解码非编码基因组区域（如增强子、沉默子等CREs）的功能，特别是它们如何通过组合来决定细胞命运、免疫应答或疾病状态，成为了可能。这项研究为未来在基因组尺度上绘制动态的基因调控互作图谱，以及基于此开发新的疾病治疗策略，奠定了坚实的技术基础。
