《Seminars in Cancer Biology》：Intratumor Heterogeneity and Clonal Evolution in Sarcomas: Molecular, Cellular, and Functional Drivers of Therapy Resistance
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这篇综述深入探讨了恶性间叶组织肿瘤——肉瘤中复杂的瘤内异质性现象及其与治疗抵抗的关系。文章以骨肉瘤、去分化脂肪肉瘤（基因组复杂型）以及尤文肉瘤、滑膜肉瘤、融合阳性（肺泡状）横纹肌肉瘤（融合驱动型）五种代表性肉瘤为模型，系统阐述了克隆及亚克隆分子改变、癌基因活性波动、细胞可塑性以及瘤内生态系统形成如何驱动疾病进展和塑造耐药性。文章强调了利用单细胞和空间组学等新技术揭示肉瘤异质性，并展望了基于此的精准医疗新策略，包括功能精准肿瘤学平台在指导个体化治疗中的应用前景。
1. 引言与范畴
肉瘤是一类生物学上多样化的间叶组织恶性肿瘤家族。尽管不同组织学亚型间的差异众所周知，但许多临床上的意外情况，例如不同病灶间的混合反应以及初始治疗有效后的早期复发，都源于瘤内异质性。ITH指的是在同一患者体内，存在着不同的遗传、表观遗传、转录组、空间、功能和时间状态。大规模分子谱分析已证实，即使是“驱动基因明确”的肉瘤也呈现分层的亚克隆结构和并行的适应性程序，挑战了单一主导病灶的生物学决定疾病结局的观念。
ITH相关现象主要有两种解释：一是克隆多样性，即遗传上不同的亚群在拷贝数畸变、驱动性病变和/或突变过程/疤痕上存在差异；二是细胞状态可塑性，即不依赖新突变即可出现的表型程序（如增殖性、应激适应性、间充质样、干细胞样），受表观遗传学和肿瘤微环境塑造。这两种机制均可播散转移灶并耐受治疗。
本综述围绕五个互补的轴心来梳理肉瘤的ITH问题：分子异质性、细胞生态系统异质性、功能异质性、空间和时间异质性。
2. 分子异质性、时间演变与治疗驱动的动态
过去十年，大量分子图谱研究揭示了肉瘤等癌症的遗传和基因组异质性及潜在的分子靶点。这些研究主要聚焦于DNA测序，并辅以对癌症表观基因组、转录组和蛋白质组的研究，越来越详细地描绘了癌症患者间及患者内部的分子异质性，这可能转化为不同的疾病表型、治疗脆弱性和耐药机制。
早期研究利用多区域DNA测序，已证实肾癌及其转移灶中存在显著的ITH和分支式演化。然而，针对肉瘤纵向演变的研究仍然有限。例如，Hofvander等人的研究结合细胞遗传学、单核苷酸多态性阵列和全外显子组测序，对高分化脂肪肉瘤、黏液样脂肪肉瘤等基因组复杂的罕见肉瘤进行了纵向采样，为这些癌症的克隆演化提供了早期见解。
2.1. 骨肉瘤
骨肉瘤以其高基因组复杂性著称，是儿童和青少年高度非整倍体癌症的典型模型。早期观点认为骨肉瘤由持续的染色体不稳定性逐渐演化而来。Stephens等人的开创性工作发现，“染色体碎裂”——一种发生在单一灾难性事件中的大规模基因组重排——在骨肉瘤中相对常见。这一发现将范式转向认为骨肉瘤的启动源于一次基因组“大爆炸”，随后基因组演变有限。最近的多区域测序研究证实了这一观点，并提供了证据表明，染色体碎裂是一个持续发生的亚克隆突变过程（在74%的骨肉瘤病例中），其机制被称为“丢失-易位-扩增染色体碎裂”：在此过程中，一次双链断裂通过断裂-融合-桥循环，同时触发TP53失活和癌基因扩增，导致了骨肉瘤的跳跃式演化。
除了遗传来源的ITH，一项基于染色质可及性分析的研究定义了骨肉瘤肿瘤内的两种表观遗传“亚型”或细胞状态——早期和晚期成骨细胞衍生状态。重要的是，这两种细胞状态共存于给定的骨肉瘤肿瘤内，并对药物有不同的反应，凸显了ITH如何影响肉瘤的治疗结局。
2.2. 脂肪肉瘤
脂肪肉瘤是另一个基因组复杂性肉瘤的主要例子。本综述主要关注去分化脂肪肉瘤。大多数去分化脂肪肉瘤发生在腹膜后脂肪区，由去分化成分和伴随的高分化成分组成。两个成分的关键驱动因素是涉及MDM2基因的高度复杂的12号染色体扩增子，表明两者可能源自共同的祖细胞。
近期一项优雅的研究利用scRNA-seq、DNA测序和功能实验，支持了去分化脂肪肉瘤两种成分均来源于一个共同的脂肪干细胞祖细胞的假说。该祖细胞因早期获得MDM2扩增而发生转化，随后发生克隆分离和独立的平行演化。由于大多数腹膜后脂肪肉瘤病例最初采用手术切除治疗，这两种肿瘤成分的早期分离和平行演化不太可能是治疗压力选择的结果。
2.3. 尤文肉瘤
尤文肉瘤是基因组稳定的软组织或骨肉瘤的原型，由单一的显性驱动突变——一个嵌合的FET::ETS转录因子驱动和维持。关于尤文肉瘤原位ITH的演化所知甚少，但来自各种细胞系模型的证据表明，这种融合驱动的癌症在长期细胞培养中表现出非凡的基因组和表型稳定性。
除了FET::ETS融合，只有很少的复发性体细胞突变发生，例如STAG2（诊断时约20%）和TP53（约5-10%），以及一些复发的染色体获得和丢失，所有这些似乎都与较差的预后相关。初步证据表明，这些额外的突变在复发病例中富集，表明它们赋予了相应克隆更大的“适应性”和/或对所应用的化疗药物更强的耐药性。
过去十年形成并巩固了一个可能对尤文肉瘤的ITH、可塑性和克隆演化有重大贡献的新概念：与癌基因活性越高必然导致肿瘤侵袭性越强的教条相反，越来越多的证据表明，低表达的FET::ETS融合蛋白反而激活了一个转录程序，使尤文肉瘤细胞行为更具侵袭性和转移性。最近的数据表明，低FET::ETS转录活性与尤文肉瘤患者的不良预后相关。
2.4. 滑膜肉瘤
滑膜肉瘤的特征是标志性的染色体易位t(X;18)(p11;q11)，产生了SS18与SSX1或SSX2的C端抑制结构域的框内融合。SS18::SSX1/2与野生型SS18竞争SWI/SNF复合物中的位置，通过形成一种缺少肿瘤抑制蛋白SMARCB1的复合物来破坏其功能。
早期的全基因组测序研究表明，除了SS18::SSX，滑膜肉瘤体细胞突变稀少。然而，最近一项对91个滑膜肉瘤肿瘤的基因组、转录组和蛋白质组的整合分析，确定了三种不同的滑膜肉瘤亚型，分别对应已知的组织学亚型（双向分化型、单向分化型和低分化/圆细胞型）。这些亚型具有不同的分子特征和预后相关性。
另一项利用scRNA-seq和空间分析的研究揭示，一些滑膜肉瘤细胞可能处于高SS18::SSX1/2活性的状态，并定位于原位免疫缺乏的生态位，这预示着不良的临床结局。与尤文肉瘤相似，这些数据提供了另一个例子，说明融合癌基因活性的细胞间差异如何塑造ITH。
2.5. 融合阳性（肺泡状）横纹肌肉瘤
融合阳性横纹肌肉瘤是一种高级别软组织癌症，主要影响儿童和青少年，由PAX3或PAX7与FOXO1的融合形成的嵌合转录因子驱动。与尤文肉瘤和滑膜肉瘤类似，其突变负荷相对较低，仅有少数复发性突变。
早期的临床研究表明，携带PAX3::FOXO1的融合阳性横纹肌肉瘤比携带PAX7::FOXO1的临床结局更差，这可能是因为PAX3::FOXO1构成了一个效力更强的嵌合转录因子。PAX3::FOXO1癌蛋白彻底重塑了癌细胞的转录组和表观基因组。
多项scRNA-seq研究表明，融合阳性横纹肌肉瘤肿瘤由处于“祖细胞”、“增殖”和“分化”三种细胞状态景观中的肿瘤细胞组成。早期的研究表明，分化亚型的富集与更好的预后相关，并且RAF和MEK抑制剂的组合可能诱导肌源性分化。然而，关于这些细胞状态如何随时间演化，以及它们是否都与结局和治疗反应相关，仍有待确定。
3. 细胞生态系统异质性
实体瘤是复杂的动态生态系统，其中恶性细胞与其周围环境共同演化。肿瘤微环境是这个生态系统的非癌性部分，包括免疫细胞、内皮细胞、基质细胞、神经元、信号分子、代谢物、细胞外基质成分、微生物和物理力量，它们共同塑造肿瘤细胞的异质性和适应性，并深刻影响治疗反应和结局。
3.1. 肉瘤免疫景观的早期探索
受免疫检查点抑制剂在各种癌中成功的启发，多项临床试验调查了其在肉瘤中的疗效，但结果大多平平。SARC028和Alliance试验表明，未分化多形性肉瘤、黏液纤维肉瘤和去分化脂肪肉瘤等基因组复杂的肉瘤对PD-1抑制剂反应最佳，支持了基因组复杂的肉瘤比易位相关的肉瘤更具免疫原性的一般观点。
多项跨实体研究进一步将基因组复杂的肉瘤定性为免疫学上的“热”肿瘤，而将易位相关的肉瘤定性为“冷”肿瘤。然而，不同研究之间的发现存在不一致，这凸显了在可靠定义肉瘤免疫景观方面面临的关键挑战，包括缺乏标准化的评估方法、实体间的巨大差异、罕见病导致的统计困难等。
3.2. 肉瘤细胞生态系统组成与空间结构的新见解
完全捕捉肉瘤生态系统的细胞复杂性和结构需要借助scRNA-seq、空间转录组学、多重成像等超高通量单细胞技术。例如，多重免疫荧光成像可以揭示具有相似总体TME细胞组成的肉瘤生态系统在空间结构上的显著差异，例如淋巴细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞区域的浸润或排斥，这可能对应于免疫“热”或“冷”表型。
针对骨肉瘤、去分化脂肪肉瘤、尤文肉瘤、滑膜肉瘤和横纹肌肉瘤等特定类型的单细胞及空间研究，揭示了各自独特的生态系统构成、细胞状态多样性、细胞间相互作用网络以及空间生态位。例如，在骨肉瘤中，发现了成骨细胞性和成软骨细胞性恶性细胞状态共存，并分别形成富含破骨细胞、血管和免疫细胞或低血管、缺氧的微生态位。在去分化脂肪肉瘤中，去分化成分比高分化成分具有更丰富的免疫抑制性M2巨噬细胞、调节性T细胞和耗竭性CD8+T细胞浸润。在尤文肉瘤和滑膜肉瘤中，癌基因（EWSR1::FLI1或SS18::SSX）活性的异质性直接影响免疫细胞的招募和功能，并与预后相关。
这些研究共同表明，肉瘤的生态系统是高度异质且结构化的，细胞状态与空间定位紧密相关。针对特定细胞状态或生态位的治疗策略，例如靶向TGF-β信号或特定免疫检查点，可能为克服耐药性提供新的途径。
4. 功能异质性、持久性细胞与精准肿瘤学
功能异质性指的是遗传相似的癌细胞之间在行为上的差异，例如增殖、转移能力、治疗耐受性、代谢、运动性以及与肿瘤微环境的相互作用。这些不同的功能使细胞能够在治疗等选择压力下适应和生存。
一个关键贡献者是药物耐受持久性细胞状态：这些罕见的、通常是缓慢循环或休眠的细胞，无需新突变即可耐受本应致命的治疗，常常逃避凋亡；这种表型是暂时的，在撤药后可逆。药物耐受持久性细胞很可能是最小残留疾病的种子并驱动复发，为完全耐药克隆的出现提供了储备库。
在精准肿瘤学中，目前治疗决策由整合免疫组化和基因组肿瘤特征的已验证框架指导。实体驱动的策略已取得巨大成功。然而，高风险、进展性或复发性癌症仍然是主要挑战。因此，越来越多的努力致力于整合功能精准肿瘤学——离体药物测试和其他功能读数——以发现可靶向的脆弱性、应对功能异质性并完善治疗建议。
一种策略是在从手术或活检获得的活体患者来源组织中测量肿瘤特异性的离体药物反应，以补充基因组数据。功能精准肿瘤学平台可以测试单一药物和组合，使用包括单细胞悬液、患者来源类器官、肿瘤球和小鼠异种移植模型在内的多种模型。考虑到肿瘤异质性和可行性限制，患者来源的三维短期培养物已成为主要的功能精准肿瘤学形式，因为它们保持了细胞多样性和药物反应。
在肉瘤领域，功能精准肿瘤学已应用于泛肉瘤队列以及特定实体。研究表明，离体药物敏感性谱分析在临床可行的时间内是可行的，并能保持肿瘤的分子谱和异质性。功能精准肿瘤学指导的治疗在包括尤文肉瘤、骨肉瘤和横纹肌肉瘤在内的儿童和青少年复发/难治性癌症中显示出改善结局的潜力。
例如，在骨肉瘤中，大规模的药物筛选已识别出包括蛋白酶体和核输出抑制在内的可靶向脆弱性。患者来源的类器官和肿瘤球模型也已建立，用于药物测试，并且离体药物敏感性与临床反应相关的情况已有报道。在尤文肉瘤中，系统性的药物敏感性谱分析为临床前测试提供了敏感和耐药的模型，患者来源的细胞和3D肿瘤球模型已用于识别可操作的脆弱性。
总而言之，功能异质性和药物耐受持久性细胞是肉瘤治疗抵抗的核心机制。整合基因组和功能精准肿瘤学方法，利用患者来源的模型进行离体测试，为识别个体化的治疗策略、克服耐药性并最终改善肉瘤患者（尤其是那些标准治疗方案已耗尽的患者）的结局提供了有前景的途径。然而，仍存在挑战，包括优化模型建立方案、标准化分析方法以及在前瞻性临床试验中验证功能精准肿瘤学预测的临床效用。
