一种逐步组装策略，用于提高荧光ALP检测的灵敏度

Al3?检测与荧光探针开发：基于ARS/P复合物超分子组装的Al3?、PPi及ALP高灵敏检测系统。通过Al3?配位增强ARS/P荧光亮度，构建荧光turn-on探针，并验证其在复杂血清中检测ALP的可行性，提供低成本、商业可用试剂的解决方案。

　　

冯华庚|陈春园|徐星|张晓莉|董慧|王永祥|邵从英|苗婷芳|徐茂田

河南省神经退行性疾病生物标志物检测与诊断重点实验室，河南化学与生物传感及重大疾病早期诊断联合国际研究实验室，商丘师范学院化学与化学工程学院，商丘476000，中国

摘要

开发出具有卓越亮度的荧光探针是实现荧光分析法灵敏、可重复和可靠性能的关键。除了合成新型荧光探针外，改进现有大规模生产的成熟探针的功能也非常有意义，尽管近年来已经合成了数千种有机小分子荧光探针。在这里，我们展示了通过Al³⁺的配位诱导组装，显著增强了Alizarin Red S (ARS)/PyB(OH)₂ (A/P)复合物的亮度。基于这一显著的发光变化，我们开发了一种新的Al³⁺检测荧光激活方法。Al³⁺的引入使得A/P/Al³⁺组装体非常适合构建灵敏的荧光检测方法，因为Al³⁺提供了识别位点。通过理论计算（包括HOMO–LUMO能隙和构型变化）对观察到的性能进行了合理解释。因此，我们提出了一种高灵敏度的PPi和ALP检测系统。与其他基于Cu²⁺或Cd²⁺的ALP检测方法不同，所提出的基于Al³⁺的检测方法允许进行开-关式读数。此外，通过检测复杂胎牛血清中的ALP，验证了该检测系统的实用性。这一策略也可以扩展到提高其他现有荧光探针的亮度，相关研究目前正在我们的实验室进行中。

引言

铝是地壳中最常见的金属元素，含量约为8.3%。由于铝及其合金材料具有优异的物理和化学性质、机械性能以及良好的加工性能，因此被广泛应用于各种行业，如运输车辆、净水材料、制药、炊具和可食用铝箔等[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。然而，随着铝工业的快速发展，由于不当排放和后处理问题，环境中的Al³⁺含量显著增加。Al³⁺可能通过食物链进入人体。一旦摄入，它倾向于与蛋白质结合，使其难以通过代谢过程排出体外。研究表明，人体内Al³⁺的过量积累与多种神经退行性疾病的发病机制有关，例如帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症[6]。此外，异常量的Al³⁺还与其他有害影响相关，包括骨软化症、贫血、肺功能受损、纤维化和慢性肾衰竭等[7]。为了控制Al³⁺的危害，相关部门对饮用水和每日摄入量制定了明确的规定。建议人体平均每日摄入的Al³⁺量为3–10毫克。世界卫生组织（WHO）将饮用水中Al³⁺的最大允许浓度定为7.41微摩尔[8]、[9]。因此，有效监测微量Al³⁺对环境和人类健康至关重要。

焦磷酸（PPi）参与DNA合成和ATP水解等关键生物过程，其水平与多种疾病有关[9]。因此，检测PPi在关节炎和软骨钙化症等疾病的诊断中具有重要意义。此外，工业废水中的PPi是一种难以处理的含磷污染物。检测PPi也有助于环境保护和生态安全。更重要的是，PPi是碱性磷酸酶（ALP）检测中最常用的底物之一。作为一种普遍存在的膜结合酶，碱性磷酸酶（ALP）广泛分布于多种哺乳动物系统中，定位于骨骼、肾脏、肝脏和胎盘等组织中，并可在唾液、血清、脑脊液和尿液等体液中检测到[10]、[11]、[12]、[13]。作为重要的水解酶，在碱性介质中，ALP可以催化多种磷酸酯（包括小分子、核酸和蛋白质）的脱磷酸作用，从而在调节细胞内过程、分子运输、骨骼矿化和免疫反应等各种生理过程中发挥关键作用。成人血清中的正常ALP水平在40至190 U/L之间[13]。血清ALP水平与多种疾病有关，如糖尿病、癌症、阿尔茨海默病、心血管疾病和骨质疏松症[14]、[15]。ALP已被用作疾病监测和医学诊断的生物标志物。因此，已经建立了多种可靠、灵敏、高效、便携且经济的方法，如分光光度法[16]、荧光法[17]、化学发光法[18]、磁共振成像[19]、表面增强拉曼散射（SERS）[20]和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）[21]，用于体外和体内的ALP检测。在这些方法中，基于荧光的检测系统特别吸引人，因为它们具有操作简单、灵敏度高、选择性好、样品体积要求低等优点。特别是便携式荧光分析仪的出现进一步扩展了其应用范围。PPi与其他ALP底物的区别在于其较低的最佳pH值[22]、[23]。荧光探针/Cu²⁺（或Cd²⁺）复合物已被证明能有效地与水溶液中的PPi结合。然而，Cu²⁺和Cd²⁺通过与荧光团的能量转移机制、电子转移机制或Dexter型机制（双电子交换）结合而淬灭荧光[24]。基于这些金属离子的荧光ALP检测方法均为“开-关”类型。‘开-关’型酶探针的校准可能会受到竞争性淬灭过程的影响，导致无法区分的发光响应。通常认为，基于‘开-关’行为的传感器优于基于‘关-开’行为的传感器。

构建荧光激活检测系统的关键在于开发具有优异光学性能的荧光探针。目前，已经开发出了数以万计的荧光探针，包括有机小分子荧光探针、生物大分子荧光探针和基于纳米材料的荧光探针。尽管后两种类型的荧光探针已得到广泛应用，但它们仍面临一些挑战，如合成复杂、水溶性有限、灵敏度不足和成本高昂。有机小分子荧光探针因其种类繁多、结构易于修改和波长范围广等优点而被广泛使用[25]。目前，开发新型有机小分子荧光探针的主要方法是通过共价键将荧光团和识别单元连接起来。实际上，近期文献中报道了大量有机小分子荧光探针[26]。然而，有机小分子荧光探针也存在一些挑战，如激发光谱窄、水溶性低以及合成过程繁琐。除了使用现代合成技术合成新型有机小分子荧光探针[27]外，通过非共价相互作用（静电相互作用、配位等）构建超分子组装体也是一种替代的、重要的且有趣的方法。Dey等人基于阴离子荧光染料与生物聚合物之间的静电相互作用，开发了一种新型ALP检测方法，具有关闭式读数[28]。基于超分子配位自组装/解组装的荧光探针特别吸引人，因为它们制备简单、水溶性好且成本低。然而，需要更多的研究来广泛推广这项技术。为了获得性能优异的超分子荧光探针，我们的研究小组进行了长期探索[29]、[30]、[31]。最近，我们利用ARS（化学结构见图S 1A）和N-杂环硼酸（PyB(OH)₂（化学结构见图S 1B）之间的非共价相互作用，通过配位自组装反应获得了荧光ARS/PyB(OH)₂ (A/P)复合物（图S 1B）。构建了一种新的检测系统，并成功应用于人血清中SARS-CoV-2 N蛋白的检测。然而，A/P复合物的亮度较低，限制了检测灵敏度。构建高灵敏度检测系统的关键在于具有高亮度的荧光探针。荧光探针的亮度越高，其使用浓度越低，基于该荧光探针的荧光测定的灵敏度越高[32]。在这里，我们意外发现Al³⁺可以通过配位自组装反应显著增强A/P复合物的亮度，从而实现Al³⁺的荧光激活检测。鉴于Al³⁺本身的配位能力较弱和光谱特性有限[33]、[34]，本工作中提出的检测系统具有重要的实际意义。此外，Al³⁺作为检测系统的双重功能单元，不仅显著增强了A/P复合物的亮度，还充当了焦磷酸离子（PPi）的识别位点。通过将Al³⁺与PPi螯合，形成Al³⁺/PPi复合物，破坏了A/P/Al³⁺组装体并淬灭了它们的荧光。因此，该检测系统也可用于PPi的检测。这些特性使其成为具有开-关荧光响应的ALP检测的理想工具。ALP将PPi水解为正磷酸盐（Pi），从Al³⁺/PPi复合物中释放Al³⁺，并重新形成A/P/Al³⁺组装体，恢复其荧光。因此，该检测系统还可以扩展到具有开-关读数的ALP检测。图1说明了所提出检测系统的原理。所提出的检测系统具有一些显著的优势：首先，系统中使用的所有试剂和化学品均可商业购买。其次，与已报道的探针相比，A/P/Al³⁺组装体的制备简单，无需繁琐的合成过程，对环境和操作者友好。最重要的是，所提出的检测系统可以通过开-关-开信号读数同时检测三种分析物，这非常有前景且必要，因为它可以提高效率并降低成本。

实验部分

检测的详细信息见支持资料。

Al³⁺、PPi和ALP检测原理及可行性测试

2微摩尔的ARS不发光（图1A，曲线a）。加入20微摩尔的Al³⁺后，荧光没有明显变化（图1A，曲线b）。同样，0.25微摩尔的PyB(OH)₂的发光也很弱（图1A，曲线c）。0.25微摩尔的PyB(OH)₂与20微摩尔的Al³⁺结合时，荧光也没有明显变化（图1A，曲线d）。2微摩尔的ARS在0.25微摩尔的PyB(OH)₂存在下也发光较弱（图1A，曲线e），这表明形成了A/P复合物，与我们的最新研究结果一致。

结论

我们报道了一种基于ARS、PyB(OH)₂和Al³⁺逐步组装的三重响应高灵敏度荧光传感器，无需复杂的合成步骤。首先，ARS与PyB(OH)₂配位后，其荧光显著增强，形成低发光的A/P复合物。然后，使用Al³⁺进一步增强A/P复合物的亮度，并提出了Al³⁺的荧光激活检测方法。形成的A/P/Al³⁺组装体显示出红色发光（λ_max

作者贡献声明

冯华庚：资金获取、撰写原始稿件、可视化、验证、监督、软件、资源、方法学、数据分析、数据管理、概念化。陈春园：方法学、数据分析、数据管理、验证。徐星：方法学、数据分析、数据管理、验证。张晓莉：方法学、数据分析、数据管理、验证。董慧：资金获取、方法学、验证。王永祥：资金获取

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22474072）、商丘师范学院创业启动基金（编号：7001143）、淮北师范学院创业启动基金（编号：15601215）、安徽大学自然科学基金重点项目（编号：2024AH051671）以及河南省高校科技创新人才资助计划（编号：24HASTIT003）的财政支持。