《Journal of Oral Microbiology》：Characteristics of Candida albicans metabolism of glucose and two sugar substitutes, xylose and xylitol and effect of these substitutes on glucose metabolism from a cariogenic perspective
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本文系统研究了口腔中常见的共生真菌——白色念珠菌（C. albicans）对葡萄糖以及两种糖替代品（木糖和木糖醇）的代谢与产酸特性。结果表明，尽管白色念珠菌可以利用木糖和木糖醇，但其生长和产酸能力远低于利用葡萄糖时，提示这两种替代糖的致龋（dental caries）潜力较低。尤为重要的是，研究发现木糖和木糖醇并未抑制白色念珠菌的葡萄糖代谢。在富含葡萄糖的有氧条件下，白色念珠菌将大部分葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳（CO2），并生成少量有机酸，揭示了其在口腔微生态中独特的代谢图谱。这些发现为理解白色念珠菌在口腔健康与疾病中的作用提供了新的代谢层面依据。
引言：口腔中的白色念珠菌与糖代谢之谜
白色念珠菌（Candida albicans）是口腔中最常被分离出的酵母菌，通常被视为在健康个体中无害的共生微生物。然而，越来越多的研究表明，它与龋齿（dental caries），特别是儿童早期龋（early childhood caries, ECC）存在关联，并可能与变形链球菌（Streptococcus mutans）形成协同关系，增强生物膜形成和致龋性。尽管如此，白色念珠菌的基本生物化学特性，尤其是糖代谢及随后的产酸过程，仍知之甚少。此前研究仅鉴定出不足10%的糖代谢酸产物，摄入糖分的最终代谢命运——如何被代谢、产生何种终产物——依然未知。
与此同时，木糖醇（xylitol）及其前体木糖（xylose）作为天然糖替代品，因其低热量、低血糖指数等特性应用日益广泛。在口腔中，木糖醇不被大多数口腔细菌发酵，因此不导致龋齿，并能抑制变形链球菌的生长、生物膜形成及产酸。然而，其对白色念珠菌等其他口腔微生物的影响尚不明确。本研究旨在探究白色念珠菌对葡萄糖、木糖和木糖醇的代谢差异，评估糖替代品对葡萄糖代谢的潜在抑制作用，并全面量化其代谢终产物，以深入理解白色念珠菌葡萄糖代谢的化学计量学及其在口腔微环境中的意义。
材料与方法
本研究使用白色念珠菌JCM1537T菌株（由日本RIKEN BRC提供）进行所有实验。菌株在含有1%葡萄糖的胰蛋白胨酵母葡萄糖（TYG）琼脂平板上于37°C有氧培养24小时。生长和代谢实验在添加了1%葡萄糖、木糖、木糖醇或其组合作为唯一碳源的最低培养基——无氨基酸酵母氮源（YNB）培养基中进行。
生长培养：将菌悬液接种于含不同甜味剂的YNB培养基中，在37°C静置有氧条件下培养，定期测量520 nm光密度（OD520 nm）以监测生长。
质子（酸）产量测定：使用pH-stat系统在pH 7.0下监测和量化质子产量。细胞在指数生长期收获、洗涤，重悬于缓冲液中。加入终浓度为10 mM的底物后，通过系统自动滴定消耗的60 mM KOH量来估算30分钟内的质子产量。
酸性终产物分析：反应混合物样本经高氯酸处理后，通过高效液相色谱（HPLC）分析目标有机酸，包括琥珀酸、柠檬酸、丙酮酸、苹果酸、富马酸、乳酸、甲酸和乙酸。
非酸性终产物与葡萄糖分析：使用特定酶法试剂盒，通过分光光度计在340 nm下测量NAD+向NADH的转化，定量甘油、乙醇、乙醛的浓度以及葡萄糖的消耗量。
化学计量学分析：基于检测到的所有酸性和非酸性终产物的量以及消耗的葡萄糖量，计算碳回收率。公式为：（所有终产物的碳原子微摩尔数总和）/（消耗葡萄糖的碳原子微摩尔数）× 100%。此外，基于假设的代谢途径（包括或不包括三羧酸循环），估算还原力（2 H）和二氧化碳（CO2）的产生与消耗，计算氧化还原平衡。
结果
白色念珠菌在不同甜味剂下的生长
白色念珠菌能够在有氧条件下以葡萄糖、木糖或木糖醇作为唯一碳源生长。然而，在木糖或木糖醇上的生长速率显著低于葡萄糖，直至240小时时间点；尽管到336小时时生长率几乎追平，但仍显著较低。当木糖醇或木糖与葡萄糖共存时，均未观察到对白色念珠菌生长的抑制效应，与单独使用葡萄糖相比无显著差异。
白色念珠菌的质子（酸）产量
以葡萄糖为底物时，白色念珠菌产生的质子最多
。木糖醇或木糖的存在并未抑制以葡萄糖为底物的质子产生。在葡萄糖上生长的细胞，以木糖醇或木糖为底物时，其质子产量不高于对照（无底物），表明白色念珠菌无法有效利用这些糖替代品产酸。相反，在木糖或木糖醇上预生长的细胞，能以相应底物产生显著高于对照的质子，但产量仍远低于葡萄糖。
酸性终产物
以葡萄糖为碳源生长的细胞，其葡萄糖代谢产生的主要有机酸是苹果酸和琥珀酸。通过HPLC鉴定出的有机酸总量仅占葡萄糖代谢产生的质子总量的3.9–4.2%。而在木糖或木糖醇上预生长的细胞，其葡萄糖代谢产生的乙酸比例更高，苹果酸、琥珀酸和甲酸的比例较低。细胞在木糖上生长时，能从木糖和木糖醇产生少量酸性终产物（主要是乙酸），但在木糖醇上生长的细胞则未从这两种底物检测到酸性终产物。
葡萄糖代谢的总体验定终产物
出乎意料的是，以葡萄糖为碳源生长的细胞产生了最多的质子（推测为碳酸氢盐）和非酸性终产物，其中乙醇最为丰富。有机酸和乙醛仅占终产物的一小部分。在木糖或木糖醇上预生长的细胞，其葡萄糖代谢终产物谱相似，但总量较低。
葡萄糖代谢的化学计量学分析
对葡萄糖代谢进行化学计量学分析显示，消耗的葡萄糖碳原子中，约50.48%转化为乙醇，21.95–24.72%转化为碳酸氢盐，5.70%转化为甘油，2.88%转化为有机酸，0.12%转化为乙醛。据此计算的碳回收率为81.07–84.48%。基于假设代谢途径计算的氧化还原平衡在93.26%至93.97%之间，支持了所推测代谢途径的有效性。
讨论
白色念珠菌在葡萄糖、木糖、木糖醇及其与葡萄糖组合下的生长
与变形链球菌等传统致龋菌不同，白色念珠菌能够单独以木糖和木糖醇为碳源存活并在有氧条件下缓慢生长。许多酵母可以通过磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）将木糖和木糖醇代谢为木酮糖-5-磷酸作为能源。本研究表明白色念珠菌也具有此代谢特性。然而，木糖和木糖醇上的生长和产酸水平显著较低，这可能是由于有限的氧气可用性导致细胞内NADH积累，减慢了整体代谢和ATP产生。此外，木糖/木糖醇的摄取机制可能效率较低，且白色念珠菌存在“葡萄糖阻遏”现象，即在葡萄糖存在下会抑制替代碳源代谢相关基因的表达。一个重要发现是，木糖或木糖醇的存在完全未抑制白色念珠菌在葡萄糖上的生长和代谢，这与它们对变形链球菌的抑制作用形成鲜明对比。
质子产量与代谢终产物
白色念珠菌以葡萄糖为底物时质子产量最高，但酸性终产物仅占所产生质子的一小部分（<10%），约一半的终产物是非酸性的乙醇和甘油。这表明糖酵解产生的NADH主要用于生产乙醇和甘油。木糖和木糖醇代谢的质子产量低，可能与其代谢产生的过量NADH导致更多甘油等非酸性产物生成，而较少产生CO2（碳酸氢盐）有关。在不同碳源上生长的细胞，其酸性终产物谱存在差异：葡萄糖生长的细胞以琥珀酸为主，而木糖/木糖醇生长的细胞以乙酸为主，提示代谢途径可能不同，但有机酸总量占比很小。
基于化学计量学的葡萄糖代谢整体概览
根据代谢终产物谱和文献，本研究估算了白色念珠菌葡萄糖代谢的整体途径。高碳回收率和氧化还原平衡支持了这一途径的有效性。碳回收的赤字（16–19%）可能源于葡萄糖在细胞内积累为多糖，或部分CO2从反应体系中逸出。
传统认为，在常氧条件下，念珠菌属主要利用TCA循环和电子传递链氧化葡萄糖衍生的丙酮酸，产生CO2和水，而不产生有机酸和非酸性终产物。然而，本研究表明，在碳水化合物充足的有氧条件下，白色念珠菌可能主要通过糖酵解和部分反向TCA循环代谢碳水化合物，并消耗代谢过程中产生的还原力，产生有机酸、CO2以及乙醇和甘油等非酸性终产物。这种现象与“克雷布特里效应”（Crabtree effect）类似，即在高葡萄糖浓度下，某些酵母优先进行发酵而非高效呼吸。尽管白色念珠菌历史上被认为是克雷布特里阴性酵母，但越来越多的证据表明葡萄糖实际上会抑制其呼吸作用，使其表现出部分克雷布特里阳性特征。本研究结果表明白色念珠菌在有氧条件下从葡萄糖产生大量乙醇，也支持这一观点。
结论
白色念珠菌能够在有氧条件下代谢木糖和木糖醇并产酸。与变形链球菌不同，木糖和木糖醇并未抑制其葡萄糖代谢。然而，白色念珠菌利用木糖和木糖醇的产酸水平较低，表明其在口腔环境中的致龋潜力较低。需要指出的是，这些结果仅基于白色念珠菌的标准菌株（主要为酵母形态）获得；不同的临床分离株或菌丝形态的细胞可能因代谢变化而表现出不同行为，有待进一步研究。本研究首次揭示，白色念珠菌发酵糖类时会产生大量乙醇和CO2以及有机酸。这一关于口腔念珠菌糖代谢的整体描绘，为思考念珠菌属在口腔微生物组中的代谢功能提供了新的信息。
