编辑推荐：
本研究聚焦糖尿病合并牙周炎患者，在龈下刮治基础上联合使用罗伊氏粘液乳杆菌（L. reuteri）益生菌含片，通过16S rRNA高通量测序技术深入评估了其对龈下微生物组的影响。研究发现，尽管进行了为期3个月的每日补充，该益生菌并未在龈下微环境中实现稳定定植，也未能显著改变微生物组的α或β多样性及物种组成，提示益生菌可能通过非定植依赖的机制（如免疫调节）或系统性途径（如改善HbA1c）发挥作用，而非直接重塑龈下菌群生态。该研究结果对理解益生菌在复杂口腔-系统性疾病治疗中的作用模式具有重要意义。
正文总结
研究背景
牙周炎是一种由龈下生物膜驱动的慢性炎症性疾病，并与糖尿病（Diabetes Mellitus, DM）存在公认的双向关系。高血糖可加剧牙周组织的炎症反应，而牙周炎症也会影响全身代谢调节，这凸显了开发同时针对口腔和全身结局的治疗策略的必要性。作为一种辅助治疗手段，益生菌因其具有调节口腔菌群和宿主免疫反应的潜力而备受关注。其中，罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri， 简称 L. reuteri）是被广泛研究的菌株之一。然而，益生菌辅助治疗对牙周炎的临床及微生物学影响仍存在争议。特别是在糖尿病患者群体中，其通过调节龈下微生物组发挥作用的证据尚不明确。本研究旨在填补这一空白，探讨辅助使用L. reuteri对伴有糖尿病的牙周炎患者龈下微生物组的影响。
研究方法
本研究是一项随机、三盲、安慰剂对照临床试验的二次分析。共纳入40名患有II-III期牙周炎及糖尿病的患者。所有患者均接受了龈上洁治和龈下刮治（Subgingival Instrumentation），随后被随机分为两组：益生菌组（n=19）接受含有L. reuteriDSM 17938 和 ATCC PTA 5289两种菌株的含片，每日两次，持续3个月；安慰剂组（n=21）接受不含活性成分的含片。在基线、3个月和6个月时，从每个患者固定的4个最深牙周袋内采集龈下菌斑样本。通过对细菌16S rRNA基因的V3-V4区域进行高通量测序，并结合QIIME2和DADA2等生物信息学工具处理数据，获得扩增子序列变异（Amplicon Sequence Variants, ASVs）。使用混合效应模型分析α多样性，使用PERMANOVA分析β多样性，并使用LinDA（线性模型差异丰度分析）进行物种水平的差异丰度分析，以评估益生菌干预对微生物组的影响。
研究结果
微生物样本与基线特征
研究最终纳入116个高质量测序样本进行分析。受试者多为III期牙周炎患者（92.5%）和2型糖尿病患者（95.0%）。两组的基线临床特征（如平均年龄、性别分布、吸烟比例）及牙周探诊深度（Probing Depth, PD）无统计学差异，且两组的牙周临床参数在治疗后均有显著改善，但组间无差异。
α与β多样性分析
研究通过绘制稀疏曲线（Rarefaction Curves）和比较多种α多样性指数（观察到的ASVs数、Faith's 系统发育多样性指数、Shannon指数）发现，无论是随时间推移还是在益生菌组与安慰剂组之间，均未观察到显著差异。箱线图也直观地显示了个体间的高变异性，但组间和不同时间点的平均α多样性保持稳定，混合效应模型证实了无统计学意义。在β多样性方面，基于非加权/加权UniFrac距离和Aitchison距离的PCoA/PCA分析表明，两组在所有时间点的微生物群落结构都存在大量重叠，且PERMANOVA分析未发现组间、时间点或交互作用在统计学上的显著差异。0.05). (PERMANOVA p > 0.05 for all metrics).">
L. reuteri的定植情况
一个关键发现是L. reuteri在龈下微环境中定植效果不佳。尽管益生菌组患者每日服用含片，但在该组19名受试者中，有10人在所有时间点均未检测到该菌。仅有一名受试者在基线时显示出相对较高的丰度（0.51%），但在6个月时下降至极低水平。其余受试者仅偶尔在单一时间点检测到低丰度的L. reuteri。安慰剂组也观察到了类似的低水平、不规律的检出情况。总体而言，在组间对比中，益生菌组的L. reuteri相对丰度并未显著高于安慰剂组。
微生物组成与差异丰度分析
在门水平和属水平的堆叠条形图中，两组的微生物组成在基线、3个月和6个月时均保持稳定。主要优势菌门包括厚壁菌门（Bacillota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和梭杆菌门（Fusobacteriota）。优势属包括梭杆菌属（Fusobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）和链球菌属（Streptococcus）。无论是治疗后还是益生菌干预，均未观察到明显的群落结构重组模式。此外，在对全部377个检测物种进行的差异丰度分析中，在错误发现率校正后，未发现任何物种在益生菌组与安慰剂组之间存在随时间变化的显著差异。
讨论与结论
本研究的主要发现是，在伴有糖尿病的牙周炎患者中，辅助使用L. reuteri益生菌含片六个月，并未能显著改变龈下微生物组的多样性（α和β多样性）或组成。核心原因在于L. reuteri菌株未能成功、持续地在龈下微环境中定植。这与肠道益生菌研究中的发现一致，即宿主的固有微生物群落通常对外源性益生菌具有很强的定植抵抗。此外，安慰剂组在龈下刮治后也未显示出显著的微生物组变化，提示龈下生态系统的复原力很强，机械性清创本身对微生物组的影响有限且短暂。
值得注意的是，尽管在微生物组层面未观察到差异，但该临床试验的主要报告指出，益生菌组在6个月时出现了比安慰剂组更显著的糖化血红蛋白（HbA1c）降低。这表明益生菌可能通过肠道-口腔-系统轴等途径，发挥不依赖于局部微生物组改变的全身性代谢调节作用，例如改善胰岛素敏感性、减少系统性炎症等。因此，益生菌对牙周炎合并糖尿病患者的潜在益处，可能更多体现在系统性代谢改善，而非直接重塑龈下菌群。
研究的局限性包括样本量非专为微生物学终点设计，以及患者在整个研究期间的口腔卫生控制欠佳（全口菌斑指数接近40%），这可能促进了病原菌的早期再定植，并阻碍了益生菌的植入和持续作用，从而掩盖了潜在的治疗效应。此外，16S rRNA测序虽然能进行全面的群落分析，但无法评估功能层面的变化。未来的研究可考虑采用多组学技术，并探索联合益生元、多菌株制剂或新型递送系统等策略，以增强益生菌在口腔复杂环境中的定植和功效。
综上所述，在本研究的条件下，对于患有牙周炎和糖尿病的患者，在龈下刮治基础上辅助使用L. reuteri益生菌，并未能有效改变其龈下微生物组的多样性或组成。益生菌的作用可能更依赖于对宿主免疫系统的瞬时调节或通过全身途径改善代谢，而非在龈下生态位中建立稳定的定植。
