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为解决酶类药物靶点特异性不足、毒性较大等难题，研究人员通过大规模突变筛选与热力学建模，首次系统描绘了Src激酶的全域变构调控网络。该研究揭示激酶域内变构通讯具有方向性、距离依赖性等特征，并鉴定出多个此前未知的、具有潜在成药性的变构口袋。这项工作为开发高特异性激酶变构抑制剂提供了全新框架，对肿瘤等疾病的精准治疗具有重要意义。
在生命活动的精密调控中，酶扮演着至关重要的角色，它们催化着从基因表达到新陈代谢、信号传导乃至神经计算的几乎全部生物过程。因此，酶也成为小分子药物最大的靶点类别。然而，当前大多数酶抑制剂都采用了一种“正构”作用机制，即直接结合在酶高度保守的活性位点上。这带来一个棘手的难题：由于同一家族不同成员的活性位点结构非常相似，针对一个酶的药物往往会“误伤”其他多个同族酶，导致脱靶效应和严重的毒副作用。这在拥有538个成员的蛋白激酶家族中尤为突出，靶向ATP结合口袋的经典抑制剂通常会对数十甚至数百种不同的激酶产生抑制。
为了突破这一瓶颈，科学家们将目光投向了“变构调节”。变构，被誉为“生命的第二个秘密”，指的是分子结合在蛋白质的某个远端位点，却能远程调节其活性中心功能的现象。变构位点通常比活性位点保守性更低，因此靶向变构位点的药物有望实现更高的特异性和更低的毒性，并能对酶活性进行精细的微调，例如部分激活或定量调节。尽管变构调控潜力巨大，但绝大多数酶（包括大多数激酶）的变构位点仍未被发现和绘制。我们不知道一个激酶表面众多潜在的可成药口袋中，哪些真正具备变构调控活性，这严重阻碍了高特异性变构药物的研发。
在此背景下，一项发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究取得了突破性进展。研究团队以人类重要的原癌蛋白Src激酶为模型，开发了一种通用性策略，首次全面绘制了酶活性的正向与负向变构调控图谱。为了解决传统正构抑制剂特异性差的问题，并系统性探索激酶的未知变构调控网络，研究人员设计并开展了大规模的高通量遗传筛选实验。
研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：
- 1.
大规模变异文库构建与深度突变扫描：针对Src激酶域，设计了覆盖所有可能单氨基酸替换（超过5万个基因型）的突变文库，并在多种不同的遗传背景下进行测试，以获取足够数据用于模型拟合。
- 2.
双重复合表型定量：在酵母细胞中平行进行两项高通量筛选。一是利用激酶活性依赖性毒性生长抑制实验，定量每个变异体的催化活性；二是利用三明治式蛋白片段互补分析法（sPCA），定量每个变异体的可溶性蛋白丰度。两者均具有高重复性和良好的体内外验证相关性。
- 3.
热力学能量建模：基于上述活性与丰度数据，构建并拟合了一个“酶折叠与激活”的三态热力学模型。该模型成功解耦了突变对蛋白折叠自由能（ΔΔGf）和催化活性自由能（ΔΔGa）的单独贡献，从而揭示了纯粹由变构效应引起的活性变化。
研究结果
激酶折叠的稳定性图谱
研究首次全面揭示了突变如何影响蛋白激酶折叠在体内的丰度。研究发现，位于蛋白质核心（尤其是C叶）的突变更容易破坏稳定性，其中疏水的αF螺旋及其相邻的αE螺旋、β7、β8片层构成了激酶折叠的主要稳定核心。位于E435和R509之间的盐桥是对突变最敏感的长程相互作用。相比之下，N叶（含ATP结合位点）对突变的耐受性更高。同时，研究也鉴定出了48个能提高细胞内Src丰度的稳定化突变。
Src激酶的变构能量图谱
通过建模，研究获得了所有5111个单氨基酸替换对催化活性的独立影响图谱（ΔΔGa）。共鉴定出1070个显著调节激酶活性的变构突变，其中961个为抑制性，109个为激活性。研究发现，Src的功能丧失既可通过蛋白去稳定化实现，也可通过特异性失活实现，两者概率相近。
主要变构位点
研究定义了42个主要变构位点，其中21个是直接接触活性位点的“第二壳层”位点。这些位点包括所有11个此前通过分子动力学模拟预测的、连接底物和ATP结合位点的变构网络残基，验证了计算预测的准确性。抑制性变构突变在调控激酶激活的关键结构元件中富集，如发生构象变化的αC螺旋、激活环（包括自抑制磷酸化位点Y419）、αEF和αG螺旋等。其中，调节性脊柱（R-spine）的所有残基突变均表现出强烈的失活效应，而催化性脊柱（C-spine）中仅直接接触ATP的残基突变富集失活效应。
变构通讯的距离依赖性与各向异性
突变对活性的平均影响强度随其与活性位点三维距离的增加呈指数衰减。有趣的是，抑制性突变的效应随距离衰减明显，而激活性突变的效应则无此距离依赖性，提示两者机制不同。变构通讯的效率具有强烈的方向（各向异性）依赖性，不同空间方向的衰减速率差异高达六倍以上，且与蛋白质的二级结构类型相关。
动态非共价接触与变构
分析发现，仅在激活态或在不同构象间发生接触“交换”的残基，其突变更可能影响Src活性。这突出了构象 ensembles（系综）变化和动态分子相互作用在变构信息传递中的关键作用。
表面口袋的优先级排序
通过整合结构信息与变构能量数据，研究对Src激酶表面的28个潜在成药口袋进行了系统性排序。结果不仅确认了已知的变构抑制剂靶点（如ATP位点、DFG口袋），还发现了10个此前在任何激酶中都未报道过的、全新的变构活性口袋，为新药研发指明了全新方向。
调控结构域对变构图谱的调制
研究还比较了全长Src与其单独激酶域的变构图谱。尽管全局变构网络高度保守，但在与SH2等调控结构域相互作用的界面及其邻近区域，突变效应存在显著差异。全长背景下，破坏自抑制相互作用的突变（如C末端尾部的Y530）激活效应更强，同时也在C叶发现了一个可能远程缓解SH2域抑制的突变簇。
研究结论与重要意义
这项研究成功构建了首个酶活性的全域变构调控图谱。它系统揭示了Src激酶域内变构通讯的普适性、距离依赖性、方向性及其与动态结构特征的关联。更重要的是，该图谱以无偏倚的遗传学数据为基础，为激酶表面众多潜在成药口袋提供了定量的优先级排序，直接服务于药物发现。研究鉴定出的多个全新变构口袋，表明即使是对Src这样已被深入研究的蛋白，其靶向治疗的空间仍远未被充分探索。
这项工作建立了一个可推广的框架。只要能够对目标酶的活性和折叠丰度进行大规模定量，该方法就可应用于其他激酶乃至任何重要的治疗性或生物技术用酶。通过在不同蛋白质中绘制类似的变构图谱，我们将能深入理解变构位点的进化与保守规律，并积累足够规模和多样性的数据来训练机器学习模型，最终实现对所有蛋白质变构位点的准确预测、靶向和设计。这为开发更高特异性、更低毒性的下一代靶向药物，攻克癌症等重大疾病，奠定了坚实的基础。
