《Renal Failure》：LncRNA Gm44981 modulates EZH2–H3K27me3–p21 axis to suppress mesangial cell senescence and kidney aging
Abstract
随着社会文明与医疗技术的进步，人类预期寿命显著延长，与年龄相关的疾病（如慢性肾脏病CKD）的患病率也显著增加，对老年人的生活质量和临床实践构成了一系列挑战。器官老化伴随着结构和功能的改变以及对疾病易感性的增加。长链非编码RNA（lncRNAs）在衰老肾脏中常常失调，然而，调控肾脏老化的关键lncRNAs及其相关机制尚不清楚。本研究通过对年轻和老年小鼠的肾脏组织样本进行无偏见的全转录组测序，发现长1943 bp的lncRNA Gm44981在衰老肾脏中表达下调。荧光原位杂交（FISH）分析显示，Gm44981主要位于肾小球系膜细胞（MCs）的细胞核中。功能实验表明，在MCs中过表达Gm44981显著促进了细胞增殖能力。具体而言，过表达Gm44981与H3K27me3水平升高以及EZH2在Cdkn1a（p21）启动子区域的富集增强相关，这进而与Cdkn1a表达抑制和MCs衰老减缓相关联。总之，我们的研究结果突显了lncRNA Gm44981在调控肾小球系膜细胞衰老中的关键作用，并为抗衰老治疗提供了新的靶点。
Introduction
人类的衰老过程以多种器官系统的进行性功能衰退以及宏观和微观组织学改变为特征，肾脏因其极其活跃的代谢特征而尤为突出。虽然衰老本身并不直接导致肾脏损伤，但伴随肾脏衰老发生的分子、结构和功能变化是急性肾损伤（AKI）和CKD发病率增加的关键诱因和高危因素。在衰老过程中，肾小球基底膜增厚和系膜基质扩张等肾小球结构的改变，是导致肾功能不可逆下降甚至纤维化的最重要危险因素。细胞衰老是机体慢性疾病发展和衰老过程中的常见现象。肾小球系膜细胞是肾小球中最重要的组成部分之一，对于维持系膜基质稳态、调节肾小球滤过率和保持正常肾功能至关重要。肾脏衰老过程通常伴随着MCs功能失调，例如MCs异常增殖和细胞外基质（ECM）沉积。因此，剖析衰老MCs的动态分子特征有助于阐明衰老的细胞信号机制，并探索延缓甚至逆转肾脏衰老的潜在靶点。
长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的RNA，具有多种功能效应，包括表观遗传调控、（后）转录基因调控和区室化。越来越多的证据强调了lncRNAs在调控发育过程和疾病发病机制（包括癌症、炎症和衰老）中的重要作用。近期的研究也揭示了lncRNAs在与衰老相关的肾脏疾病（如糖尿病肾病、肾小球疾病和肾纤维化）的发病机制中起着关键的调控作用。然而，这些研究主要集中在与肾脏衰老和肾脏疾病进展相关的lncRNAs上，而对于延缓甚至逆转肾脏衰老的核心lncRNA及其相关机制仍不清楚。
尽管EZH2介导的H3K27me3修饰是一种已在多种组织中涉及细胞衰老的公认表观遗传机制，但其在肾脏衰老——特别是在肾小球系膜细胞内的调控特异性——仍未得到充分理解。先前的研究主要集中在EZH2在衰老相关转录沉默中的广泛作用，然而，以细胞类型和背景依赖性的方式将EZH2引导至特定基因组位点的上游调节因子仍然在探索中。LncRNAs最近被认为是关键的分子引导者，它们能将表观遗传复合物募集到特定的基因启动子，从而精细调节衰老程序。然而，lncRNAs是否以及如何在肾脏衰老中协调EZH2靶向衰老相关基因，在很大程度上尚未被探索。
在这项研究中，我们将lncRNA Gm44981鉴定为一种在肾脏衰老中下调的新型转录本，主要定位于肾小球系膜细胞。我们证明了Gm44981特异性招募EZH2到Cdkn1a启动子，增强H3K27me3沉积并表观遗传地抑制Cdkn1a表达，从而延缓系膜细胞衰老。我们的发现不仅揭示了Gm44981是系膜细胞衰老的关键调节因子，而且提供了一个机制范例，即组织富集的lncRNA将EZH2活性导向特定的衰老相关基因位点，为肾脏衰老的表观遗传调控提供了新的特异性层面。
Methods
动物样本：本研究收集了5只3个月大（年轻）和5只24个月大（年老）的C57BL/6J小鼠的肾脏组织。所有小鼠均在标准环境中饲养，自由获取食物和水。收集的组织被液氮冷冻并储存在-80°C。通过尾静脉注射AAV-Gm44981或阴性对照AAV-nc，建立了Gm44981过表达模型的SAMP8雄性小鼠。
RNA测序分析：对年轻和年老小鼠肾脏组织进行全转录组测序，以分析lncRNAs的表达。使用Illumina Novaseq? 6000平台进行RNA测序。将高质量序列比对到小鼠参考基因组（GRCm38），并使用DESeq2/edgeR进行差异表达分析。
细胞培养：小鼠肾小球系膜细胞系SV40 MES 13（MCs）购自国家细胞库。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C、5% CO2的细胞培养箱中培养。
试剂与转染：为过表达Gm44981，设计和合成了Gm44981的过表达质粒和阴性对照。使用Lipofectamine 2000按照制造商说明进行质粒和siRNA转染。
RNA提取与实时荧光定量PCR：使用Trizol试剂从肾脏或培养细胞中提取总RNA。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达，以GAPDH作为内参。
细胞增殖实验：使用细胞计数试剂盒-8（CCK8）测定法测量细胞增殖。
流式细胞术分析：通过碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析细胞周期分布。
蛋白质印迹法：使用特异性一抗（如anti-p21， anti-H3K27me3， anti-Cdk2， anti-actin， anti-GAPDH）进行蛋白质印迹分析，检测蛋白表达水平。
荧光原位杂交：使用特异性探针进行FISH实验，以定位Gm44981在细胞内的分布。
RNA免疫沉淀：使用RIP试剂盒检测Gm44981与EZH2的结合能力。
染色质免疫沉淀：使用ChIP试剂盒，通过抗EZH2和抗H3K27me3抗体进行染色质免疫沉淀，检测它们在Cdkn1a启动子区域的富集情况。
组织病理学：对小鼠肾组织进行苏木精-伊红（H&E）、过碘酸雪夫（PAS）和马松（Masson）三色染色，以评估组织学变化。通过透射电子显微镜（TEM）观察超微结构。使用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒检测衰老细胞。
统计分析：符合正态分布的测量数据以均数±标准差表示。两组间比较采用非配对Student's t检验；多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Bonferroni校正的事后检验。p值 <0.05认为具有统计学显著性。
Results
年老与年轻小鼠肾脏中差异表达的lncRNAs
为了剖析对肾脏衰老至关重要的关键lncRNA，研究者对年轻和年老小鼠的肾脏组织样本进行了全转录组测序。主成分分析（PCA）揭示了衰老肾脏与年轻肾脏之间lncRNA表达的显著差异。与年轻肾脏相比，在衰老肾脏中共鉴定出130个上调、91个下调的lncRNAs。在这些下调的lncRNA中，Gm44981在年轻小鼠肾脏中的表达显著高于年老小鼠肾脏。qPCR进一步验证了Gm44981在衰老肾脏组织中的表达下调。借助UCSC数据库发现，Gm44981位于小鼠6号染色体上，由1个外显子组成。编码潜能分析（CPC和PhyloCSF）表明Gm44981不具备蛋白质编码能力。免疫荧光染色显示，Gm44981主要在肾小球中表达。总之，lncRNA Gm44981主要在肾小球中表达，并且在衰老肾脏中表达下调。
Gm44981通过下调衰老相关分泌表型和细胞周期基因调控MCs衰老
上述结果表明，Gm44981在肾小球中特异性表达，且衰老肾脏中Gm44981的表达水平降低，提示其在肾脏衰老中可能具有保护作用。由于系膜细胞是肾小球的主要细胞成分，研究者接下来探究了Gm44981是否调节其衰老。为了研究Gm44981在MCs中的功能，研究者进行了功能获得和功能缺失实验。首先，研究者将过表达质粒和siRNA转染入MCs，并检测Gm44981的表达以验证过表达质粒和siRNA的效率。随后，研究者检测了衰老相关分泌表型（SASP）基因（IL6、CCL2和CXCL10）的表达，这些是衰老细胞产生的标志性分泌因子。有趣的是，结果显示在oe-Gm44981的MCs组中，SASP基因显著下调，而siRNA处理则显著增加了MCs中SASP基因的表达。这表明Gm44981对细胞衰老的抑制作用导致了SASP的减少。为了进一步探索Gm44981对MCs衰老的影响，研究者测量了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKIs）基因（如Cdkn2b、Cdkn2a、Cdkn1a、Cdkn1b）的表达。qRT-PCR结果显示，转染Gm44981过表达质粒后，MCs中Cdkn1a的表达显著下降。此外，蛋白质印迹分析证实Gm44981对p21蛋白表达水平的调控有显著影响。这些结果与Gm44981在调控MCs衰老中的作用一致，表现为其与SASP基因IL6、CCL2、CXCL10以及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21的下调相关。
Gm44981促进MCs增殖能力
鉴于Gm44981在调控MCs衰老方面的能力，研究者进一步探讨了Gm44981是否影响衰老MCs的增殖能力。CCK8实验表明，Gm44981的表达水平与细胞活力高度相关，表明上调Gm44981可促进MCs的增殖速率，反之亦然。研究者进一步分析了MCs在受到oe-Gm44981和siRNA扰动时的细胞周期分布。有趣的是，流式细胞术分析显示，当MCs转染Gm44981过表达质粒时，处于G1期的MCs百分比下降，而S期的百分比增加。此外，在MCs中转染Gm44981 siRNA导致S期细胞百分比下降，G1期和G2/M期细胞百分比增加。这些结果表明，Gm44981在促进MCs增殖能力方面起着至关重要的作用。
Gm44981通过与EZH2在其启动子区域的富集相关来抑制Cdkn1a表达
已有研究报道，与年龄相关的CpG位点的DNA甲基化可能是衰老和健康的生物标志物，这些位点也常被PRC2的催化亚基EZH2结合。PRC2催化H3K27me3，可招募DNA甲基转移酶（DNMTs）以促进这些位点的DNA甲基化。研究者进一步探讨了Gm44981是否可以通过影响H3K27me3水平来通过表观遗传调控衰老过程。FISH结果显示，Gm44981分布在细胞核和细胞质中，但主要位于细胞核，这表明lncRNA Gm44981可能参与细胞核内的转录调控。相互作用概率分析显示Gm44981与EZH2之间存在高结合评分。研究者在转染了Gm44981过表达质粒的MCs中检测了组蛋白甲基化水平，发现与阴性对照相比，H3K27me3的表达大幅增加。相反，敲低Gm44981则显示出相反的效果。这些结果表明，Gm44981对H3K27me3水平的调控有显著影响。众所周知，PRC2的组蛋白甲基转移酶EZH2通过催化H3K27me3来抑制基因转录。Gm44981是否可以通过EZH2抑制肾脏中Cdkn1a的表达尚不清楚。为了从功能上评估EZH2-H3K27me3轴是否是Gm44981效应所必需的，研究者用EZH2甲基转移酶抑制剂GSK126处理MCs。正如预期，GSK126处理显著降低了整体的H3K27me3水平，同时增加了p21蛋白的表达。关键的是，当过表达Gm44981的MCs与GSK126共同处理时，Gm44981介导的p21减少和Cdk2增加在很大程度上被消除。这一药理学干预实验表明，EZH2的酶活性对于Gm44981发挥其对p21的抑制效应及其促增殖结果是必要的，为该表观遗传途径的参与提供了功能支持。RIP实验显示，与IgG对照相比，Gm44981显著与EZH2结合。为了进一步探究Gm44981是否通过招募EZH2到p21启动子来抑制p21转录，研究者在过表达Gm44981的MCs中进行了ChIP分析。ChIP实验证明，Gm44981过表达增加了EZH2的占据和H3K27me3在Cdkn1a启动子区域的沉积。结合RIP数据，这些发现支持了一个模型，即Gm44981与EZH2结合，并在Cdkn1a的特定基因组位点促进其表观遗传抑制功能。
体内过表达Gm44981抑制肾脏衰老
为了进一步在体内检验Gm44981对肾脏衰老的调控作用，研究者通过尾静脉注射建立了过表达AAV-Gm44981的SAMP8小鼠模型。通过免疫荧光确认了Gm44981在小鼠肾脏中的表达。与对照组相比，AAV-Gm44981组的肾小管萎缩评分、肾间质纤维化评分和系膜基质胶原沉积等肾脏指标均有所改善。在AAV-nc组的SAMP8小鼠肾脏中，肾小球系膜区增生，足细胞足突间歇性融合，滤过屏障受损。而在AAV-Gm44981组中，肾小球系膜区增生减少，足细胞足突排列有序，滤过屏障结构完整。与AAV-nc组相比，AAV-Gm44981组的SA-β-gal阳性面积显著减少。此外，研究者检测了衰老相关蛋白的表达，发现AAV-Gm44981组肾组织中p21表达下降，Cdk2表达增加。细胞衰老的一个重要特征是SASP的出现，它由一系列细胞因子组成。研究者随后检测了SASP的RNA表达水平，结果显示，与阴性对照组相比，AAV-Gm44981组中IL-6、CCL2和CXCL10的表达显著降低。总之，这些结果表明Gm44981可以在体内抑制肾脏衰老。
Discussion
随着人类预期寿命的持续延长，器官系统衰老及相关疾病已成为国际关注的焦点。肾脏是一个高代谢器官系统，在血液净化中起着重要作用，肾脏衰老引起的肾功能损伤给人类的健康和生活质量带来了许多问题。
在肾脏衰老过程中，肾小球和肾小管的多种细胞经历了不同程度的生理变化，尽管部分损伤通过代偿得以减轻，但肾功能的下降是不可逆的。细胞衰老是细胞周期永久性停滞的一种状态，其特征是显著的代谢活动和细胞形态的剧烈变化，对人类器官衰老有重大影响。MCs是肾小球中最重要的内在细胞成分之一，MCs内的衰老与肾功能障碍直接相关。因此，理解MCs衰老过程中的分子变化对于开发延缓甚至逆转肾脏衰老的潜在靶点至关重要。
LncRNAs可以作为分子支架，已被证明可以引导表观遗传因子至染色质结构，进而通过染色质修饰、转录和转录后加工来调节基因表达。先前的研究强调了lncRNAs在促进包括肾脏在内的多个器官衰老中的新兴重要性。我们的研究鉴定出lncRNA Gm44981是系膜细胞衰老的新型抑制因子，通过EZH2-PRC2表观遗传途径发挥作用。我们的数据与一个模型一致：细胞核富集的Gm44981促进了EZH2在关键衰老基因p21启动子处的富集及抑制性组蛋白标记H3K27me3的沉积，从而导致其转录沉默。这种募集增强了抑制性组蛋白标记H3K27me3的沉积，导致转录沉默。这一发现直接将Gm44981与肾脏衰老的表观遗传控制联系起来，将其定位为衰老肾小球染色质景观的关键调节因子。
这种表观遗传沉默的下游效应汇聚于核心的p21-Cdk2衰老轴。通过抑制衰老的主要介质p21，Gm44981减轻了对Cdk2活性的制动。这一作用促进了G1/S期进程，抵消了G1期阻滞，并促进了细胞增殖。此外，Gm44981过表达有效抑制了以SASP为代表的细胞衰老标志物，显著降低了促炎因子（IL-6、CCL2）的表达。因此，Gm44981通过表观遗传地抑制衰老网络中的中枢节点，协调了一个多方面的抗衰老程序。
对抗年龄相关表观遗传漂变已成为衰老研究的前沿。诸如使用senolytics清除衰老细胞、调节sirtuins以增强基因组稳定性以及重新校准表观遗传时钟等策略，反映了针对衰老基本机制的范式转变。我们对Gm44981的发现与这一概念框架完美契合。与年龄相关的Gm44981下降代表了肾脏中的一种表观遗传漂变形式，而其恢复则修正了特定基因位点异常的H3K27me3景观。因此，我们提出Gm44981作为“候选肾脏表观遗传修饰剂”——一种天然存在的lncRNA，其活性对于维持肾小球年轻化的表观遗传和细胞状态至关重要。
本研究揭示的机制为未来的治疗发展开辟了令人兴奋的途径。AAV介导的Gm44981体内过表达的成功，凸显了AAV-lncRNA疗法在治疗年龄相关性肾脏疾病方面的潜力。更精确的干预措施可以利用与EZH2或去甲基化酶结构域融合的CRISPR-dCas9表观遗传编辑器，直接在p21启动子或其他衰老相关基因处重写表观遗传密码，为从表观遗传根源逆转肾小球衰老提供策略。此类干预的主要目标是恢复系膜细胞稳态，从而阻止或逆转系膜基质的扩张，保护肾小球滤过屏障，从而减轻随年龄增长的肾功能衰退。尽管在递送和特异性方面仍存在挑战，但靶向像Gm44981这样的关键表观遗传修饰因子，代表着实现肾脏“年轻化”的一条有前景且创新的路径。
我们在Gm44981-EZH2-p21轴上的发现具有超越生理性衰老的重要意义，延伸至几种常见的慢性肾脏病（CKD）。在糖尿病肾病（DKD）中，系膜扩张是一个标志性的病理特征，已知p21激活会促进系膜细胞衰老和基质过度产生，从而促进疾病进展。我们的数据表明，Gm44981的下调导致p21去抑制，可能是衰老和DKD中驱动系膜病理的共同机制。类似地，衰老与CKD进展过程中的通路存在广泛重叠，由p21等关键调节因子协调的细胞衰老越来越被视为共同的通路之一。我们观察到的EZH2和p21失调也是衰老的共同特征，与初始损伤无关。因此，我们鉴定出的Gm44981-EZH2-p21通路可能代表了一个连接各种损伤刺激与系膜细胞衰老和肾小球硬化的共同分子节点，使其成为一系列年龄相关和进展性肾脏疾病的有前景的治疗靶点。
Limitations and future perspectives
尽管如此，本研究存在一些局限性，指出了未来的重要研究方向。Gm44981与EZH2在p21启动子的关联需要通过直接的相互作用实验（例如RNA pull-down）进一步验证，并且需要进行遗传拯救实验以最终确定EZH2是不可或缺的介质。虽然SV40 MES13细胞系是一个有价值的模型，但它可能无法完全重现原代系膜细胞的生物学特性，应检查其他衰老标志物（例如p16INK4a、γH2AX）以确定受调控的通路。此外，Gm44981是全局性地影响EZH2占据，还是优先影响衰老相关基因位点，仍需通过全基因组表观遗传谱分析来阐明。最后，虽然全身性AAV9递送改善了肾脏衰老，但系膜细胞与其他肾细胞类型的相对贡献需要使用细胞类型特异性工具进行研究。解决这些问题将进一步阐明Gm44981如何在肾脏衰老中精细调控表观遗传。
总之，我们的研究表明，过表达Gm44981会导致p21启动子区域的H3K27me3表达水平增加，从而抑制p21表达，最终抑制细胞衰老。
Conclusion
总之，我们的研究结果表明Gm44981是与MCs细胞周期进程和抑制衰老相关的关键调节因子。这种效应与p21表达的负调控以及EZH2介导的H3K27me3甲基化的上调相关，提示了一个潜在的机制通路，这可以作为肾脏衰老的有前景的靶点。
