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碳纳米管羟基化（MWCNT-OH）和石墨烯氧化物（GO）作为电极材料，通过电化学免疫传感器检测H1N1病毒血凝素蛋白。采用PET基便携式三电极系统，MWCNT-OH传感器检测限0.058 fg/mL，线性范围5-5×10^6 fg/mL，优于GO传感器。
吕月英|朱奎健|李佳木|何杰|张瑞|杨正春|彭盼|李华义|程亚辉|郑凌城|李传和|王春红
天津工业大学集成电路科学与工程学院、先进材料与印刷电子中心、薄膜电子与通信器件天津市重点实验室，中国天津300384
摘要
甲型流感（H1N1）病毒具有人际传播能力，对公共卫生构成严重威胁。本研究报道了一种基于羟基化多壁碳纳米管（MWCNT-OH）的超灵敏免疫传感器，用于检测H1N1血凝素蛋白。同时，该传感器也与基于相同碳基材料石墨烯氧化物（GO）的传感器进行了对比。为了解决传统三电极系统不适合便携式检测的问题，本研究选用了聚对苯二甲酸乙二醇酯材料制成的丝印碳电极。这种电极不仅完美解决了上述问题，还显著降低了成本。免疫传感器通过抗体与血凝素蛋白之间的特异性反应引起的电位变化来检测免疫反应。电信号通过差分脉冲伏安法检测，检测限采用3N方法计算。结果表明，MWCNT-OH免疫传感器具有高灵敏度和特异性，检测限低至0.058 fg/mL，线性范围为5 ~ 5×10^6 fg/mL；而GO免疫传感器的检测限为0.083 fg/mL，线性范围为50 ~ 5×10^5 fg/mL，性能略逊于MWCNT-OH免疫传感器。这得益于MWCNT-OH较大的表面积、孔隙体积及缺陷结构，这些因素为免疫传感器提供了更多的活性位点。研究表明，基于碳纳米管的传感器有望发展成为实用的临床筛查工具。
引言
甲型流感病毒（H1N1）可迅速在人类和某些动物中引发致命的呼吸道疾病[1]，给全球公共卫生系统带来了前所未有的压力[2][3]。目前，H1N1病例仍时有发生，造成巨大的经济和社会损失[4][5][6]。H1N1病毒颗粒通常呈球形或丝状，直径约为80至120纳米[7]。其关键表面蛋白血凝素（HA，分子量约70 kDa，等电点约5.0-6.5）通过特异性受体结合位点识别并结合宿主细胞表面的唾液酸寡糖受体。这种相互作用不仅促进了病毒与宿主细胞的结合，还决定了病毒对不同宿主和细胞类型的结合特异性，是流感病毒感染过程中的关键初始步骤[8]。目前有多种灵敏且特异的分子检测方法可用于H1N1的检测，如聚合酶链反应（PCR）、逆转录酶（RT）PCR、酶联免疫吸附测定（ELISA）、病毒斑块试验、表面等离子体共振和核酸杂交[9][10][11][12]。然而，基因材料的分离操作耗时较长，需要专业技术人员和昂贵的实验室设备。因此，亟需一种成本低廉、灵敏度高且便于携带的新型诊断方法。
在各种诊断方法中，免疫传感器技术被证明是检测特定抗原的非常有前景的技术[13][14][15][16][17]。其中，电化学免疫传感器凭借其小型化设计、简单的仪器配置和用户友好的操作特性，能够克服前述限制[18]。金因其良好的生物相容性和导电性而常用于免疫传感器的制备[19]。Nidzworski等人[19]通过将抗体固定在金电极上来制备了一种通用流感病毒检测免疫传感器。尽管其成本低于ELISA等传统方法，但金仍属于贵金属。Lee[20]和Reddy[21]等人使用碳基材料制备了免疫传感器，并证明这些材料在检测H1N1方面与金相当。碳基材料更具成本优势，更适合资源匮乏地区，可能成为免疫传感器的理想选择。在常见的三电极系统中，参比电极Ag/AgCl通常由涂有AgCl银线的玻璃管制成[22]，这种电极不适合便携式、小型化和集成化的诊断系统。因此，易于制备和携带的丝印电极系统逐渐成为免疫传感器的新选择[23][24]。聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）材料因其成本效益和柔韧性而成为丝印基材的首选之一。
本研究选择MWCNT-OH和GO作为传感材料，主要是因为它们都是碳基材料，具有较高的比表面积，有利于抗体的有效负载和检测信号的放大。MWCNT-OH的多壁结构使其表面易于羟基化，从而实现共价抗体结合，同时保持内部石墨层的导电性。相比之下，单壁碳纳米管（SWCNT）在过度功能化过程中容易发生结构损伤，导致导电性下降。本研究制备了基于MWCNT-OH的H1N1血凝素免疫传感器，并将其与同为碳基材料的多层石墨烯氧化物（GO）免疫传感器进行了对比。两种免疫传感器在特异性、重复性和稳定性方面进行了测试和讨论。此外，还制备了一种便携式丝印碳电极（SPCE），将工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE）集成在PET基底上，解决了传统三电极系统不适合便携式现场检测的问题。
材料与化学试剂
导电碳浆、导电银浆、FeCl3和绝缘油墨分别购自辽阳鸿图碳化物有限公司、北京Sino.Com.Nav.科技有限公司、天津Kevin化工有限公司和Ten International Ink有限公司；MWCNT-OH和GO购自苏州Carbon Rich科技有限公司；戊二醛（GA）和牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma-Aldrich公司；H1N1多克隆抗体（H1N1 Ab）、H1N1 HA、H3N2 HA、H5N1 HA和H7N9 HA分别来自相关供应商。
电极表征
MWCNT-OH和GO的晶体结构通过XRD分析，如图3所示。MWCNT-OH在2θ = 26.1°和2θ = 43.3°处出现两个特征衍射峰，分别对应于(002)和(100)晶面[33]；GO在2θ = 10.6°和42.4°处出现两个特征峰，分别对应于(001)和(101)晶面[34][35]。
图4a中的MWCNT-OH FTIR光谱显示在1552.90 cm^-1处有明显吸收峰，这归因于C=C骨架的存在。
结论
本研究提出了一种基于PET的电化学免疫传感器，使用一次性柔性SPCE电极在5 ~ 5×10^6 fg/mL浓度范围内无标记地检测H1N1血凝素（H1N1 HA）。该传感器的检测限为0.058 fg/mL，灵敏度为5.62 μA·cm^-2·(fg/mL)^-1，具有优异的特异性、重复性和稳定性，线性范围更广，检测限更低，优于基于GO的免疫传感器。这得益于MWCNT-OH较大的表面积和良好的导电性能。
作者贡献声明
程亚辉：方法学设计、实验研究。
郑凌城：方法学设计、实验研究。
李华义：数据分析、数据整理。
何杰：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验研究、资金申请。
张瑞：撰写、审稿与编辑。
杨正春：方法学设计、实验研究。
彭盼：数据分析。
李传和：实验研究。
王春红：实验研究。
朱奎健：数据整理。
吕月英：初稿撰写、方法学设计、实验研究。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号62304153）和天津市重点研发计划（项目编号22YFYSHZ00280、24YFYSHZ00200、24YFYSHZ00130、24YFYSHZ00140）的支持。作者感谢Shiyanjia实验室（
www.shiyanjia.com）提供的宝贵帮助。
