一种非标准的、兼职工作的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH/GapA）能够从血红素、转铁蛋白和乳铁蛋白中获取铁

A. baumanniiGapA具有独特N端延伸和铁摄取功能，为药物开发新靶点

　　

安贾利·库马里（Anjali Kumari）、扎希德·加尼（Zahid Gani）、尼玛·拉梅什（Nimma Ramesh）、施雷娅·盖克瓦德（Shreya Gaikwad）、阿贾伊·库马尔（Ajay Kumar）、拉胡尔·迪拉瓦里（Rahul Dilawari）、阿普尔瓦·马哈詹（Apurwa Mahajan）、拉杰什·库马尔·罗希拉（Rajesh Kumar Rohilla）、桑加拉林加姆·库马拉兰（Sangaralingam Kumaran）、马诺杰·拉杰（Manoj Raje）、查雅·艾扬格尔·拉杰（Chaaya Iyengar Raje）

印度旁遮普邦SAS纳加尔国家制药教育与研究学院（NIPER）生物技术系，邮编160062

摘要

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，简称A. baumannii）由于多重耐药菌株的迅速传播而成为重点关注病原体。尽管如此，该病原体的许多代谢途径仍不为人所知，目前主要依据大肠杆菌（E. coli）的研究进行推断。对临床分离株的A. baumannii进行的全基因组分析发现缺乏多种糖酵解酶，但Entner-Doudoroff（ED）途径的所有酶均被鉴定出来，不过尚未对其功能进行详细研究。此外，该途径产生的两种产物——3-磷酸甘油醛（G3P）和丙酮酸——可生成脱氧木酮糖-5-磷酸（deoxyxylulose 5-phosphate），后者是维生素B6合成的关键中间体。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）在不同物种间高度保守，尽管存在序列差异，其功能酶通常为约150 kDa的同源四聚体，由约37 kDa的单体组成。本研究发现A. baumannii表达一种异常大的酶，分子量为约212 kDa，其单体大小为53 kDa。这种A. baumannii酶的独特之处在于其N端含有396 bp的延伸序列，包含132个氨基酸。序列分析表明这一N端序列存在于多种不动杆菌物种中。本研究对重组蛋白GapA进行了全面的生化特性分析，并发现该蛋白能够结合并内化人类转铁蛋白（Tf）、乳铁蛋白（Lf）和血红素（heme），从而实现铁的获取。鉴于其在碳代谢、维生素B6合成和铁获取中的关键作用，A. baumannii的GapA可能显著促进细菌致病性。此外，其独特的结构差异为开发特异性抑制剂提供了可能性。

引言

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，简称A. baumannii）属于ESKAPE病原体群，该群体包括粪肠球菌（Enterococcus faecium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和肠杆菌属（Enterobacter）物种。这些病原体导致了大多数医院获得性感染，且与较高的死亡率相关。耐碳青霉烯类抗生素的A. baumannii已被世界卫生组织列为重点病原体，凸显了迫切需要寻找药物靶点和开发新药的必要性[1]、[2]。为了发现新的药物靶点，必须深入分析影响细菌致病性的代谢途径。对于A. baumannii而言，其大部分代谢途径的认知基于大肠杆菌（E. coli的研究，最近也有基因组分析的支持。然而，对A. baumannii菌株的分析表明，由于其通过水平基因转移和基因重组的能力，其基因组结构存在显著差异[3]、[4]。

关于荚膜多糖生物合成的研究表明，A. baumannii利用Entner-Doudoroff（ED）途径进行葡萄糖代谢。这一途径被认为比大多数生物体中存在的Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径或糖酵解途径更为原始[5]、[6]。

对A. baumannii临床分离株的全基因组和蛋白质组分析证实其缺乏糖酵解酶，如己糖激酶和丙酮酸激酶。尽管如此，所有ED途径的酶在A. baumannii中均被检测到[7]、[8]、[9]。ED途径通过KDPG醛醇酶将2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）转化为3-磷酸甘油醛和丙酮酸。随后的代谢反应在ED途径和EMP途径中都是共同的，为生物合成提供能量和前体物质。

ED途径与维生素B6合成途径相交。代谢中间体3-磷酸甘油醛（G3P）、二羟基丙酮磷酸（DHAP）和丙酮酸参与维生素B6的合成[10]。尽管这些物质至关重要，但其代谢途径及其相关酶尚未经过实验验证。

ED途径中的核心酶是3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapA），它催化G3P向1,3-二磷酸甘油酸（1,3 BPG）的转化。CRISPR敲低实验表明A. baumannii的GapA对细菌生存至关重要[11]。已知细菌的GAPDH不仅通过其代谢功能促进致病性，还通过其他非代谢功能发挥作用[12]，但在A. baumannii中的这些作用尚未被研究。

本研究对A. baumannii的GapA的生化、代谢和非代谢功能进行了分析。序列分析和蛋白质表达显示，该蛋白N端具有独特的132个氨基酸延伸序列，这一序列在多种不动杆菌物种中存在，但在大肠杆菌和其他细菌中不存在。蛋白质纯化证实GapA的单体大小约为53 kDa，而其功能酶的大小约为212 kDa。相比之下，其他来源的GAPDH单体大小约为37 kDa，四聚体大小约为150 kDa。随后对重组蛋白rGapA进行了酶活性分析，发现其对已知GAPDH抑制剂的敏感性较低。最后，在细菌细胞表面检测到该蛋白，发现它能够结合并吸收人体铁载体蛋白转铁蛋白（Tf）和乳铁蛋白（Lf），同时还能结合血红素。总体而言，GapA在碳水化合物代谢、维生素B6合成和铁获取等关键功能中的重要性及其独特序列表明其具有开发特异性小分子抑制剂的潜力。

数据库分析

使用KEGG（map00030）和BioCyc ID ENTNER-DOUDOROFF-PWY数据库来识别参与A. baumannii ED途径和维生素B6合成途径的基因[13]、[14]。

序列比对

A. baumannii（D0CBS2）的GapA及其同源物霍乱弧菌（Vibrio cholerae（A0A085S6B3）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae（A0A081IL39）、大肠杆菌（Escherichia coli（P0A9B2）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium（A0A0F7J7R0）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa（A0A072ZRA1）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori（P55971）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis（A0A063XHM9））的GapA氨基酸序列

Entner-Doudoroff（ED）途径与脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）依赖的维生素B6合成途径的交叉

目前尚未有研究确定A. baumannii中的糖酵解途径或类似途径。我们最初使用KEGG和BioCyc数据库确认了该途径所需基因的存在，但编码葡萄糖激酶（glk）和丙酮酸激酶（pyk）的基因不存在，而这些基因是更常见的Embden-Meyerhoff-Parnas（EMP）途径（即糖酵解途径）中的关键酶。然而，编码葡萄糖脱氢酶（gcd）、葡萄糖激酶（gntK）和6-磷酸葡萄糖酸的基因存在

讨论

最危险的病原体是医院获得性多重耐药菌和广泛耐药的细菌，它们对包括碳青霉烯类和第三代头孢菌素在内的多种抗生素具有抗性。其中，鲍曼不动杆菌是一种极其成功的医院获得性病原体，属于ESKAPE群体。其获取外源DNA的能力导致了多重耐药甚至全耐药菌株的出现，这些菌株越来越难以治疗

CRediT作者贡献声明

阿普尔瓦·马哈詹（Apurwa Mahajan）：负责撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。拉胡尔·迪拉瓦里（Rahul Dilawari）：方法学设计、数据分析。阿贾伊·库马尔（Ajay Kumar）：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析。施雷娅·盖克瓦德（Shreya Gaikwad）：撰写初稿、方法学设计、实验研究。拉杰什·库马尔·罗希拉（Rajesh Kumar Rohilla）：方法学设计。马诺杰·拉杰（Manoj Raje）：撰写、编辑、项目监督、资金获取、数据分析、概念构建。桑加拉林加姆·库马拉兰（Sangaralingam Kumaran）：

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突

数据可用性

所有数据均包含在手稿中

致谢

衷心感谢科学技术部通过SERB-POWER奖学金（授予编号SPF/2022/000091）以及印度医学研究委员会（ICMR（印度政府，授予编号OMI/1/2019(B)-ECD-I）提供的财政支持。NR、A Kumari和SG获得了NIPER（SAS纳加尔）的研究奖学金。AK和ZG获得了生物技术部（DBT（印度政府）的奖学金（授予编号BT/PR13469/BRB/10/1396/2015）