基于CD36适配体和AuMoS异质层的电化学生物传感器的制备，用于检测肿瘤来源的外泌体

HER2+/HR-乳腺癌亚型早期诊断、CD36检测、电化学aptasens器、AuMoS?纳米结构、exosomes生物标志物

　　

李敏英|韩允善|朴贤俊|尹大贤|尹哈英|李镇浩|李泰克

韩国首尔nowon-gu区Gwangwoon-ro 20号，光云大学化学工程系，邮编01897

摘要

乳腺癌（BC）由于早期症状不明显，通常在晚期才被诊断出来，其分子异质性很大，导致治疗效果和预后结果各不相同。在各种分子亚型中，人表皮生长因子受体2阳性/激素受体阴性（HER2⁺/HR^?）亚型的治疗抵抗性和复发率较高，这突显了早期准确诊断策略的必要性。在这项研究中，我们旨在开发一种电化学适配体传感器，用于检测分化簇36（CD36），这是一种在HER2⁺/HR^?亚型中特异性过表达的脂质转运蛋白，且在代谢重编程中起重要作用。为了提高传感性能，我们在电极上涂覆了金修饰的二硫化钼（AuMoS?），以促进电荷转移和信号放大。通过指数富集法系统进化配体，我们制备出针对CD36的适配体，使其能够产生与浓度成比例的线性响应。该生物传感器表现出高选择性和低检测限（LOD），在10%的人血清中可检测到0.4 pM的CD36。此外，使用来自HER2⁺/HR^?细胞的外泌体进行检测时，其LOD可达1.2×10³颗粒/mL，显示出很强的临床应用潜力。这种基于适配体的电化学生物传感平台是一种非侵入性的即时检测方法，适用于HER2⁺/HR^?亚型的早期诊断，为分子靶向乳腺癌诊断提供了新的思路。

引言

乳腺癌（BC）是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率持续上升[1],[2]。传统的乳腺癌诊断主要依赖于影像学方法。尽管人工智能的整合提高了诊断精度[3],[4]，但这些方法仍受限于高成本、辐射暴露以及难以解析组织内的微妙分子或基因变化[5],[6]。乳腺癌通常在无明显临床症状的情况下潜伏发展，因此基于影像学的筛查难以早期发现分子或细胞异常。结果，往往在肿瘤已经形成后才能确诊[7],[8]。此外，由于传统诊断方法主要依赖于形态学评估，在区分不同分子亚型方面存在局限性[9],[10]。不同分子亚型的乳腺癌在临床结果和治疗反应上存在显著差异[11],[12]。人表皮生长因子受体2阳性（HER2⁺）亚型占所有乳腺癌病例的约20%，在肿瘤发生和疾病进展中起关键作用[13],[14]。HER2⁺靶向治疗显著提高了无进展生存期和总生存期。然而，由于该亚型具有较高的复发和转移倾向[15],[16]，因此开发能够在治疗干预前早期检测亚型异质性的诊断技术仍是重要的研究课题。在此背景下，识别和检测可靠的生物标志物是精准肿瘤学的核心。准确的分子分类有助于制定个性化治疗策略，优化治疗效果和患者预后。

与当前医学理念一致，分析体液中生物分子的非侵入性诊断方法能够在减少患者负担的同时实现早期疾病检测[17],[18]。外泌体作为细胞间传递的介质[19]，因其结构稳定性和细胞特异性分子特征而成为潜在的非侵入性生物标志物[20],[21]。这些纳米级囊泡促进了肿瘤细胞与其周围微环境之间的信息交换[22],[23],[24]。这些功能特性在乳腺癌细胞（BCCs）中也得到了证实。此外，装载在外泌体中的蛋白质和核酸对乳腺癌诊断具有临床价值[25]。结合乳腺癌来源的外泌体与无细胞DNA的整合分析还能提高亚型分类的准确性[26]。这些发现表明，基于外泌体的诊断方法具有高度敏感、非侵入性的检测能力和亚型区分潜力，可在疾病监测和治疗决策中发挥作用。尽管如此，基于外泌体的非侵入性生物传感器仍需要一个能够在含有多种干扰因素的复杂生物流体中检测目标物质的分析平台[27]。

在肿瘤微环境中，脂肪细胞通过分泌生物活性信号分子和提供脂肪酸（FA）在乳腺癌进展中起关键作用，这些脂肪酸是促进乳腺癌细胞侵袭性和增殖能力的关键代谢底物[28],[29]。分化簇36（CD36）是一种负责FA摄取和转运的跨膜受体，在HER2⁺/激素受体阴性（HR^?）乳腺癌中过度表达，与肿瘤生长、代谢重编程和转移潜能密切相关[30],[31]。尽管CD36作为临床相关生物标志物的认识日益增强[32]，现有的分析方法主要依赖于侵入性组织活检或细胞基检测，限制了其在长期和微创监测中的应用。此外，外泌体作为疾病特异性分子信息的非侵入性载体受到越来越多的关注，亟需基于外泌体的传感平台来实现直接验证。

本研究介绍了一种基于外泌体的非侵入性电化学适配体传感器，专门用于敏感且选择性地检测CD36。通过指数富集（SELEX）法系统进化配体，开发出了针对CD36的适配体，实现了对目标蛋白的高亲和力和高选择性识别。为了最大化信号转导效率，将金修饰的二硫化钼（AuMoS?）纳米结构集成到电极界面，增强了电子转移和信号放大效果。该传感平台的性能不仅通过纯化的CD36蛋白进行了评估，还通过直接从HER2⁺/HR^?乳腺癌细胞系中分离的外泌体进行了验证，证明了其在生物学相关条件下的实际应用性。CD36与适配体修饰电极表面的相互作用通过电子转移电阻的变化转化为电化学信号，在10%的人血清环境中实现了可靠检测。通过结合细胞来源的外泌体分析、完全由适配体工程化的识别系统以及电化学信号转导，本研究建立了一种稳健的CD36检测工作流程，展示了基于外泌体的生物传感平台在侵袭性乳腺癌亚型代谢生物标志物监测中的潜力。图1提供了CD36适配体传感平台的示意图。

材料

人CD36和CD63蛋白购自中国北京的中生生物公司（Sino Biological）。圆形Au微电极由韩国京畿道的SNI Technology公司制造。人血清、牛血清白蛋白（BSA）、肌红蛋白（MYO）、血红蛋白（Hemo）、半胱胺、3 K孔径的Amicon超离心过滤器、氯金酸（HAuCl₄）、六氰合铁（II）三水合物（K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O）和六氰合铁（III）（K₃[Fe(CN)₆）均购自Sigma-Aldrich公司（St. Louis）。

CD36靶向适配体的选择

多轮SELEX富集过程使得DNA文库中具有高特异性和亲和力的序列得到选择性富集（图2a）[35],[38]。SELEX过程中使用的DNA文库包含用于扩增的保守序列以及可能对目标分子具有特异性结合亲和力的随机序列。控制随机序列的长度可以在结合特性上引入多样性[41]。然而，过长的随机序列……

结论

本研究专注于高风险HER2⁺/HR^?亚型的早期检测，该亚型治疗难度大，临床预后较差。我们构建了一种针对CD36的电化学适配体传感器，这种生物标志物在该亚型中过度表达。传感器界面设计考虑了临床样本的有限可用性，而生物探针的策略性选择确保了成本效益。使用AuMoS₂实现了信号放大。

CRediT作者贡献声明

李敏英：撰写原始稿件、可视化处理、验证、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。韩允善：撰写原始稿件、验证、实验研究、数据分析、数据整理。朴贤俊：撰写、编辑、验证、数据整理。尹大贤：验证、数据整理。尹哈英：撰写、编辑、验证。李镇浩：撰写、编辑、验证。李泰克：撰写、编辑、验证。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金由韩国政府（MSIT）提供（项目编号：2021R1C1C1005583），以及韩国贸易工业能源部（MOTIE）资助的“材料与组件技术发展计划”（项目编号：RS-2024-00507931，旨在开发用于分析老年人炎症性疾病的复合阵列诊断材料和预处理模块），同时还得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助。