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聚电解质多层表面通过结合Tanfloc和CMKC在钛纳米管上，有效抑制凝血、抗菌及促进内皮化，并减少平滑肌细胞增殖，优于传统肝素涂层。
Somayeh Baghersad|Liszt Y.C. Madruga|Roberta M. Sabino|Alessandro F. Martins|Ketul C. Popat|Matt J. Kipper
科罗拉多州立大学生物医学与化学工程学院，美国科罗拉多州柯林斯堡，80526
摘要
与血液接触的医疗设备容易发生血栓形成、感染和内皮化受损等问题，这些问题通常通过药物来处理，尽管存在全身性副作用的风险。作为一种替代方案，表面改性可以提供一种局部策略来提高血液相容性并减少血液-材料界面的并发症。肝素化表面已用于与血液接触的应用中数十年，因为肝素化能够模拟血管内壁并赋予多种生化功能，从而改善血液相容性。然而，动物来源的肝素产品存在多个挑战，这促使人们寻找替代品。在这项研究中，我们开发了多功能聚电解质多层膜（PEMs），使用聚阳离子Tanfloc（TAN）与肝素以及潜在的植物来源和动物来源的替代物——羧甲基-κ-卡拉胶（CMKC）、κ-卡拉胶（KC）或透明质酸（HA）结合，沉积在二氧化钛纳米管（TiNT）表面上。我们详细表征了CMKC，这是一种同时具有硫酸基和羧基官能团的化学改性多糖，旨在复制甚至超越基于肝素的涂层的抗凝和抗菌性能。TAN-CMKC涂层表现出优异的生物效果，包括显著减少纤维蛋白原吸附、最小化血小板和白细胞粘附，并对临床相关的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有更强的抗定植能力。此外，这些多层膜显著加速了内皮细胞的粘附、增殖和迁移，同时抑制了平滑肌细胞（SMC）的增殖和表型变化。比较分析显示，CMKC的硫酸基和羧基官能团的组合显著提高了血液相容性、内皮化和抗菌效果，优于仅含硫酸基（KC）、羧基（HA）或动物来源肝素的涂层。这项工作证实了TAN-CMKC PEMs是一种强大的、可持续的生物材料策略，适用于先进的心血管设备涂层。
引言
与血液接触的医疗设备，包括血管支架、人工心脏瓣膜和透析膜，在现代医学中至关重要[1]、[2]、[3]。尽管这些设备起着关键作用，但它们仍面临血栓形成、细菌感染和再狭窄等持续存在的挑战，这些问题会损害其性能和患者预后[1]、[2]、[3]、[4]。血栓形成是由于蛋白质吸附、血小板粘附和血小板激活在血液-材料界面发生[1]、[2]。此外，这些表面上的细菌定植增加了感染和生物膜形成的风险，而这些情况难以通过传统治疗方法控制[2]、[3]。在血管植入物中，内皮细胞（EC）功能障碍和血液-材料界面的相互作用受损进一步加剧了这些并发症，破坏了血管稳态[1]、[2]、[5]、[6]。再狭窄主要是血管支架的问题，由平滑肌细胞（SMC）的增殖和迁移引起[2]、[4]、[6]。每个问题都可以通过给药来解决，但这会导致副作用。一种更有针对性的策略是设计一种能与引起这些问题的各种生物成分更友好地相互作用的表面[1]、[3]。这种方法的一个例子是支架表面的开发。血管支架对于治疗冠状动脉疾病和恢复狭窄或阻塞血管的血流至关重要[3]、[5]。从裸金属支架发展到药物洗脱支架（DES）显著降低了再狭窄率，因为DES抑制了SMC的增殖[7]。然而，DES也会延缓EC的再生，导致内皮化不完全，从而增加了晚期支架血栓形成的风险[3]、[6]。研究人员专注于血液-材料界面，开发了能够抵抗凝血和增生并促进再内皮化的表面改性技术。提出的表面改性技术包括物理和化学处理，这些处理可以修改表面或释放药物和生物分子[3]。钛（Ti）及其合金由于其优异的机械强度、耐腐蚀性和生物相容性，在心血管应用中得到广泛使用[3]。通过可调的纳米级拓扑结构，二氧化钛纳米管阵列（TiNTs）进一步增强了蛋白质吸附和细胞反应[8]。然而，它们的生物惰性限制了它们主动参与生化过程的能力，导致内皮化延迟和再狭窄及血栓形成的风险增加[3]、[5]、[7]、[8]。虽然功能化策略在解决这些限制方面显示出潜力，但仍迫切需要同时解决血栓形成、感染、内皮化和再狭窄问题的多功能涂层[7]、[9]。基于多糖的聚电解质多层膜（PEMs）为创建多功能涂层提供了一个多功能平台。PEMs通过交替沉积聚阳离子和聚阴离子层构建，从而能够精确控制表面性质，如厚度、组成和生物活性[10]、[11]、[12]。通过整合生物活性材料，PEMs可以提高血液相容性，支持内皮化，并防止细菌粘附，使其在心血管应用中非常有吸引力[13]、[14]、[15]、[16]、[18]。多糖因其仿生特性、生物降解性和功能多样性而在生物材料研究中受到广泛关注[19]。自1963年首次报道肝素化表面以来，肝素以其抗凝和抗炎特性而闻名，因此被广泛用于修改心血管材料[3]。肝素涂层的支架移植物比未修饰表面的移植物更能抑制血小板激活[3]。对接受选择性手术的患者使用肝素涂层支架的研究表明，肝素通过减少血小板表面活化GP IIb/IIIa的表达来降低早期血小板激活[3]。这种减少的血小板激活使肝素涂层在降低血栓风险方面有效。然而，依赖动物来源的肝素，特别是猪源肝素，存在持续的安全性、伦理和供应链稳定性问题。2008年的肝素污染危机以及由过硫酸化软骨素硫酸盐引起的多起死亡事件突显了动物源产品的固有风险。同样，2018年的非洲猪瘟疫情暴露了全球肝素供应的脆弱性，强调了开发更安全和更可持续替代品的必要性[20]、[21]。多糖的化学改性是增强、开发或改变这些生物聚合物性质的重要途径。例如，硫酸化引入了硫酸基团，以制备具有肝素类似特性的多糖[22]。然而，硫酸化化学过程具有毒性，并会产生危险废物。相比之下，卡拉胶是一类已经硫酸化的植物来源多糖，可用于各种食品、制药和化妆品应用。κ-卡拉胶（KC）来自红藻，因其免疫调节和抗肿瘤特性而被用于再生医学[23]、[24]、[25]。通过羧甲基化对KC进行化学改性，可以得到羧甲基-κ-卡拉胶（CMKC），这是一种结构上类似于肝素的生物材料（图1）。与肝素一样，CMKC含有可电离的羧酸和硫酸基团，具有抗凝、抗菌和生物相容性。羧甲基化硫酸化多糖是一种比硫酸化多糖更安全、更可持续的制备肝素类似材料的方法[26]、[27]。我们的团队已经证明，CMKC是肝素等动物来源抗凝剂的可行且可持续的替代品。基于CMKC的PEMs表现出优异的细胞相容性，并能抵抗微生物粘附，特别是铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。这些PEMs还表现出优异的血液相容性，其抑制全血凝固的效果可与肝素媲美。CMKC表面减少了血小板和白细胞的粘附，从而可能提高与血液接触材料的性能。这些发现确立了CMKC作为一种创新的、可持续的生物材料，用于提高医疗设备的血液相容性和降低血栓风险[28]。在生物活性材料中，Tanfloc是一种聚阳离子缩合单宁衍生物，为PEM构建提供了互补的性质。它是可生物降解的、抗菌的，并具有抗血栓形成特性[14]、[29]、[30]，使其适用于与血液接触的设备。Tanfloc含有儿茶酚基团和胺基团，类似于贻贝粘附蛋白中的基团[29]，这种两性性质使其能够抵抗血小板粘附和激活，从而降低血栓风险[30]。儿茶酚基团与纤维蛋白原相互作用，通过防止吸附蛋白质的构象变化产生抗血小板效应，而两性性质则防止非特异性蛋白质吸附[30]。基于Tanfloc的PEMs已被证明可以减少血小板粘附、激活和血栓形成，与基于壳聚糖的PEMs相比[30]。当与肝素结合时，Tanfloc产生了协同效应，进一步增强了抗血栓形成特性，包括减少纤维蛋白原吸附、降低因子XII的激活以及抑制二氧化钛纳米管上的血小板反应[31]。具体来说，根据最近的体外研究，在二氧化钛纳米管上，Tanfloc和肝素的组合增强了EC的粘附、增殖和迁移，而不刺激SMC的增殖[32]。Tanfloc的抗菌特性有助于减少细菌定植[29]、[33]。Tanfloc是一种多功能表面涂层成分，通过解决血栓形成、感染和促进更好的组织整合问题，提高了医疗设备的血液相容性和生物活性[30]、[33]、[34]。为了满足多功能涂层中对肝素替代品的需求，本研究比较了多种替代聚阴离子作为TiNT改性表面上PEMs的成分。本研究中使用的聚阴离子包括肝素（一种众所周知的抗凝剂和血液相容性生物材料）；CMKC（肝素的有希望的替代品）；KC（用于评估CMKC中羧甲基基团的特定效果）；以及透明质酸（一种缺乏肝素和CMKC中存在的硫酸基团的多糖）。将CMKC与肝素（缺乏羧酸）和透明质酸（缺乏硫酸基团）进行比较，可以确定CMKC和肝素中羧酸和硫酸基团的组合如何产生关键的生物效果。这种新颖的方法系统地评估了纳米拓扑结构和多糖化学如何共同塑造与血液接触表面的多层涂层的性能。在之前观察到的CMKC的抗凝潜力的基础上，本研究首次将其评估扩展到细胞水平，考察了其对内皮细胞和平滑肌细胞的影响。通过将CMKC与Tanfloc结合，并将这些涂层与纳米管结构集成，本研究探讨了一种以前未探索的配置。通过对血液相容性、内皮化、SMC调节和抗菌活性的同时评估，本研究推进了心血管设备多功能涂层的候选材料鉴定。部分内容摘录
羧甲基κ-卡拉胶的合成与表征
羧甲基κ-卡拉胶（CMKC）是使用改进的Williamson醚化方法合成的[35]、[36]。反应条件和纯化步骤在补充信息（§S1.1）中有描述。合成CMKC的取代程度通过1H NMR光谱确定（§S2.1）[26]。表面改性
二氧化钛纳米管（TiNTs）是通过在电解质溶液中阳极氧化钛片制备的。这一过程在补充信息中的§S1.2.1中有描述表面表征
涂有不同数量TAN-CMKC层的TiNT表面的表面形态和化学成分分别通过SEM（图2a-d）和XPS（图2e）进行了检查。这些互补技术提供了实现均匀表面的最佳涂层厚度的见解。SEM图像（图2a–d）显示，改性后的TiNT表面保持了其有序且垂直排列的纳米管。纳米管分布均匀，没有显著变化结论
我们的发现强调了TAN-CMKC聚电解质多层膜在二氧化钛纳米管表面上的优异生物效果，全面解决了血栓形成、细菌感染和内皮化受损的问题。严格的比较评估表明，CMKC的双硫酸基和羧基功能比KC（仅含硫酸基）、透明质酸（仅含羧基）和传统的动物来源肝素涂层具有明显优势。CRediT作者贡献声明
Somayeh Baghersad：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、研究、数据分析、概念化。Liszt Y.C. Madruga：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、研究、资金获取、数据分析、概念化。Roberta M. Sabino：撰写 – 审稿与编辑、数据分析、概念化。Alessandro F. Martins：撰写 – 审稿与编辑、方法学、数据分析、概念化。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
这项研究部分或全部得到了美国国立卫生研究院（NIH）（资助编号1R21EB033511）和美国国家科学基金会（NSF）（资助编号2313878）的支持。
