编辑推荐：
双酶级联催化合成高价值天然甜味剂hesperetin dihydrochalcone（HDHC）。通过分子动力学和量子力学模拟优化酶活性位点结构，成功研发具有100% C4′-O-甲基化选择性的IeOMT_ML_L139A突变体，建立以苹果加工副产物phloretin为原料的绿色生物合成路线，最终实现30%摩尔转化率和0.55 mM产品产率。
徐淑萍|孙若彬|邓文豪|陈鹏城|范新宇|马吉|孙彦芝|吴丹|郑普
教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物技术学院，中国江苏省无锡市214122
摘要
柚皮素二氢查尔酮（HDHC）是一种高价值的天然甜味剂，但从可再生生物资源中可持续高效地生产它仍然具有挑战性。在这里，我们开发了一种双酶级联催化过程，通过3′-羟基化和O-甲基化将弗洛瑞汀（phloretin）转化为HDHC。尽管之前的研究已经实现了从弗洛瑞汀到3-羟基弗洛瑞汀51%的转化率，但由于大多数O-甲基转移酶（OMTs）对底物的选择性有限，3-羟基弗洛瑞汀的后续甲基化较为困难，因为这些酶更倾向于甲基化二氢黄酮类化合物而非二氢查尔酮类化合物。通过使用二氢黄酮类底物探针策略，我们鉴定出一种来自Clarkia breweri的异丁子香酚O-甲基转移酶（IeOMT_ML）突变体，该突变体能够成功催化3-羟基弗洛瑞汀的甲基化，生成其C3′-O-甲基化衍生物。为了实现HDHC的C4′-O-甲基化，进一步对底物A环结合口袋进行了工程改造，得到了IeOMT_ML_L139A突变体，其对C4′-O-甲基化的选择性达到了100%。分子动力学模拟和量子力学计算表明，通过精细调节结合口袋的腔体结构，可以精确控制甲基化位点的选择性，从而实现HDHC的体外合成，最终产品产量为0.55 mM，摩尔转化率为30%。这种高效且选择性的生物催化过程为利用可持续苹果加工副产物中的弗洛瑞汀具有重要意义，促进了黄酮类甜味剂的绿色制造。
引言
随着人类对甜味剂需求的增长，天然甜味剂引起了广泛的研究兴趣（DuBois等人，1977年）。新型黄酮类甜味剂柚皮素二氢查尔酮（HDHC）的甜度与新柚皮素二氢查尔酮（NHDC）相当（约是蔗糖的1800倍），同时具有抗炎和抗氧化特性，对人体健康有益（DuBois等人，1981年）。欧洲食品安全局（EFSA）的安全评估确认，在规定的使用条件下，HDHC会被代谢为无害物质，不会引发安全问题（Additives等人，2024年）。从结构上看，黄酮类化合物具有C6-C3-C6的主链（A-C-B环；图1A），其功能多样性由B/C环的取代和C环的氧化状态决定（Panche等人，2016年）。因此，对C环的修饰至关重要。HDHC具有饱和的开放C环结构，可以通过其对应的二氢黄酮酮（柚皮素）或查尔酮（图1A-a）的氢化来合成。有报道指出，使用钯纳米粒子催化的方法可以在常压下合成二氢查尔酮（Chen等人，2019年）。与化学方法相比，生物催化策略提供了更环保和高效的替代方案。然而，目前二氢查尔酮的生物合成仍然面临挑战。研究发现，一种黄酮酮裂解还原酶（Fcr）可以催化黄酮酮（图1A-b）还原为二氢查尔酮（Braune等人，2019年），但柚皮素并未被识别为该酶的底物。一些微生物菌株能够将查尔酮（图1A-b）氢化为二氢查尔酮（Janeczko等人，2013年；?u?ny等人，2020年；Stompor等人，2016年；Zou等人，2024年）。例如，Rhodotorula glutinis在72小时内实现了84%的新柚皮素二氢查尔酮产率，而Yarrowia lipolytica在120小时内的产率为71%，但相应的酶尚未被鉴定，这阻碍了工艺的优化。
弗洛瑞汀是一种有吸引力且成本效益高的起始材料，可以从苹果皮和果渣中可持续地获取，这些都是果汁产业中未充分利用的废弃物（Samota等人，2024年）。在植物中，弗洛瑞汀（图1A-c）通过羟基化和甲基化修饰成为HDHC的关键前体（Ibdah等人，2017年），但相关的酶尚未被明确。在先前的研究中，工程化的4-羟基苯乙酸酯3-羟基酶（PaHpaB03）从弗洛瑞汀（图1A-a）实现了最大51%的3-羟基弗洛瑞汀（图1A-b）转化率（Xu等人，2023年）。虽然有报道在酵母中实现了3-羟基弗洛瑞汀的从头合成（de novo synthesis），但在随后的4′-O-甲基化生成HDHC的过程中，来自Epimedium sagittatum的黄酮类O-甲基转移酶（EsFOMT）仅产生了少量的HDHC（Han等人，2025年）。
文献中关于黄酮类4′-O-甲基转移酶（F4′OMTs）的报道较少，尤其是那些能够识别二氢查尔酮的酶。在苹果植物中，甲基化反应由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的OMTs催化，这些酶分为I型和II型（Kim等人，2010年；Wen等人，2017年；见补充材料，图S1）。II型F4′OMTs通常具有很强的底物选择性和区域选择性（Liu等人，2022b），更倾向于天然底物而非非生理中间体如3-羟基弗洛瑞汀（图1A-b）。然而，工程化OMTs以改变其对新型甲基化产物的区域选择性仍然具有挑战性。甲基转移机制通常遵循SN2亲核取代反应（图1B）。尽管区域选择性的分子基础尚未完全阐明，但最近通过理性设计成功改变了OMTs的区域选择性。来自Mesembrianthemum crystillanum的PFOMT突变体（Y51R/N202W）将3′-O-甲基化活性转移到了4′-O-甲基化（Dippe等人，2022年）。同样，来自Zooshikella ganghwensis的I型OMT（ZgOMT）经过改造后，N41K/S174R和M42T/S174R突变体实现了99%的HDHC选择性，但仍产生了非目标甲基化产物（Kunzendorf等人，2023年）。最近，Kanter等人证明，来自Lentinula edodes的真菌OMT（LeOMT2）的区域选择性可以通过氨基酸突变（I53M）进行调控，将3′-OMe:4′-OMe的比例从49:51调整为10:9，并且该酶也对查尔酮和二氢查尔酮具有活性（Kanter等人，2025年）。这些研究表明，结构导向的工程改造有潜力克服天然OMTs的局限性，但对其3-羟基黄酮区域选择性的精确调控仍有限。
鉴于HDHC的应用前景（Additives等人，2024年）以及建立高效4′-O-甲基化策略的研究需求，本研究建立了一种基于全细胞的酶级联反应，从弗洛瑞汀（图1A-a）合成HDHC（图1A-c）。首先，我们筛选出了具有3′-O-甲基化活性、能够将3-羟基弗洛瑞汀（图1A-b）转化为同型异丁子香酚二氢查尔酮（图1A-d）的IeOMT突变体。随后通过结构导向的理性设计进一步调节了IeOMT的区域选择性。分子动力学（MD）和量子力学/分子力学（QM/MM）模拟阐明了区域选择性甲基化的精确调控机制。最终，开发了一种以弗洛瑞汀（图1A-a）为底物的HDHC生产双酶级联催化过程。这项工作为HDHC的可持续生物合成提供了可靠的酶学工具，推动了黄酮类物质的绿色合成方法的发展。
菌株、质粒和化学品
使用大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）进行基因表达。来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的PaHpaB（AE004091）、来自薄荷（Mentha piperita）的Mp4′OMT（AY337461）、来自玫瑰茄（Catharanthus roseus）的CrOMT6（AY343489）、来自Clarkia breweri的IeOMT（U86760.1）以及来自Mesembryanthemum crystallinum的PFOMT（AY145521.1）均由GENEWIZ（中国苏州）合成。这些基因编码的氨基酸序列列在补充材料中的表S2中。pET 28a(+)和pETDuet-1表达载体也来自该公司。
使用弗洛瑞汀底物筛选潜在的OMTs
黄酮类的甲基化修饰非常重要，但目前已知的能够识别二氢查尔酮（HDHC）的植物OMTs数量有限。大多数OMTs通常识别二氢黄酮（HDHC的前体）而非二氢查尔酮（HDHC）。因此，我们策略性地使用异丁子香酚（eriodictyol）作为底物探针，筛选能够特异性作用于3-羟基弗洛瑞汀（HDHC的前体）的OMTs（图2A）。通过在国家生物技术中心的关键词“O-甲基转移酶”及相关植物术语进行筛选
结论
本研究开发了一种高效的生物催化路线，将易于获得的植物化合物弗洛瑞汀转化为高价值的天然甜味剂HDHC。通过底物探针策略，我们鉴定出一种工程化的O-甲基转移酶IeOMT_ML，该酶最初能够催化关键中间体3-羟基弗洛瑞汀的C3′-O-甲基化。随后通过对A环结合口袋的结构导向工程改造，得到了关键的突变体IeOMT_ML_L139A，该突变体完全逆转了这一反应方向
缩写
1：查尔酮；2：二氢查尔酮；3：黄酮酮；a：在2a中指2a的4′-OH；b：在2b/3b中指2b/3b的3′,4′-OH；c：在2c中指2c的3′-OH-4′-OMe；d：在2d/3d中指2d/3d的3′-OMe-4′-OH；HDHC：柚皮素二氢查尔酮；PaHpaB03：工程化的4-羟基苯乙酸酯3-羟基酶（PaHpaB03(Q212G-F292A-Q376N）来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；OMT：O-甲基转移酶；ML：T133M/Y326L；C3′-OMe：C3′-O-甲基；C4′-OMe：C4′-O-甲基；NHDC：新柚皮素二氢查尔酮；SAM：S-腺苷甲硫氨酸；MD：分子动力学
CRediT作者贡献声明
徐淑萍：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、概念化。孙若彬：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究。邓文豪：撰写——审稿与编辑、方法学。陈鹏城：资金获取。范新宇：撰写——审稿与编辑。马吉：撰写——审稿与编辑。孙彦芝：撰写——审稿与编辑。吴丹：撰写——审稿与编辑、资源准备。郑普：撰写——审稿与编辑、资源准备、项目管理
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢江南大学的高性能计算集群平台在生物工程研究中的支持。本研究得到了国家科学技术部国家重点研发计划（项目编号：2025YFA0921202）的财政支持。
