《Biosensors and Bioelectronics》：Highly fluorescent copper nanoclusters as programmable reporters for CRISPR/Cas12a-based detection of bacterial DNA
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CRISPR/Cas12a与DNA-模板铜纳米簇（CuNCs）结合开发了一锅端荧光检测法，实现皮摩尔级灵敏度细菌DNA检测，适用于点-of-care诊断。
A.G. Carota|F. Spiaggia|N. Poma|P. Palladino|D. Cuffaro|F. Vivaldi|C. Ravelet|F. Di Francesco|M. Minunni
CNR-电子与信息通信工程研究所，意大利比萨
摘要
早期且便捷的病原体检测对全球公共卫生安全至关重要，这需要快速、经济且适用于现场检测的诊断方法。本研究提出了一种成本低廉、检测迅速的一锅法荧光检测方法，该方法利用了基于DNA模板构建的铜纳米簇（CuNCs）的独特光学特性。这些纳米簇由于合成过程环保、光稳定性高以及斯托克斯位移大，成为传统荧光染料的可持续替代品。该检测方法将CuNCs与CRISPR/Cas12a系统结合，实现了可编程且高度特异性的目标识别。当目标分子与CuNCs结合时，Cas12a/gRNA复合物被激活，从而切割负责CuNCs形成的DNA模板，导致荧光显著减弱。通过系统评估多种发夹结构及多胸腺嘧啶DNA序列，最终选定了一种富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（AT-rich）的茎环结构作为报告基因，该结构在目标识别时能产生强烈的荧光信号并完全关闭荧光。最终开发的CRISPR-CuNCs检测方法达到了皮摩尔级别的灵敏度，能够准确检测参考菌株、临床分离株及添加了DNA的血清样本中的大肠杆菌 DNA，且无需使用荧光染料-淬灭剂探针或多步骤操作。总体而言，本研究证明了将CRISPR/Cas12a的可编程性与DNA模板铜纳米簇的多功能性及低成本相结合，可以构建出一个稳健且易于使用的分子诊断平台，具有很大的现场应用潜力。
引言
金属纳米簇（NCs）是一种超微材料——通常尺寸小于1-2纳米——其性质介于孤立原子和较大纳米颗粒之间（Maity等人，2019年）。由于尺寸依赖性的量子限制，它们具有离散的能级和强烈的光致发光（PL）特性，这与传统金属纳米颗粒的光学行为不同（后者由电子集体振荡产生）。这些特性，加上优异的斯托克斯位移、高光稳定性和简单的合成方法，使得NCs在光电学、光催化、成像和传感领域具有广泛应用价值（Lettieri等人，2022年；Zhao和Li，2020年）。铜纳米簇（CuNCs）尤其具有吸引力，因为铜相对于贵金属来说价格低廉、毒性低且储量丰富。CuNCs已被广泛用作传感探针，既可以通过分析物诱导生长实现，也可以通过与表面配体的相互作用实现（An等人，2020年）。其合成可以通过多种试剂稳定，包括蛋白质、肽、聚合物和小分子及寡核苷酸（Guo等人，2016年；Lettieri等人，2021年、2022年；Spiaggia等人，2025年）。其中，基于DNA模板的CuNCs（DNA-CuNCs）因其可编程性而脱颖而出。双链DNA（dsDNA）能有效促进CuNCs的形成，而三链和大多数单链DNA（ssDNA）则不能（Rotaru等人，2010年）。例外情况是长度超过20个碱基的多胸腺嘧啶（poly-T）ssDNA序列，其荧光强度随长度增加而增强。富含腺嘌呤-胸腺嘧啶（AT-rich）的dsDNA序列也被证明是有效的模板（Qing等人，2013年；Rotaru等人，2010年；Song等人，2015年；Spiaggia等人，2025年）。在文献中使用的不同DNA模板中，Peng等人用于检测S1核酸酶活性的DNA-CuNCs模板因其优异的光学特性和更高的荧光强度而脱颖而出（Peng等人，2018年）。他们的DNA模板由一个24个碱基对（AT-TA）的茎区和一个单链环区组成。当CuNCs在这些模板上生长时，其荧光强度显著提高。作者并未明确解释为何这些序列会产生更高的荧光强度，仅指出“拥挤环境”，即受限的DNA结构，可能会显著增强DNA-CuNCs的荧光强度。
规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统及其相关Cas蛋白已迅速从基因编辑工具发展成为强大的分子识别平台，用于生物传感（Aman等人，2020年；Bonini等人，2021b年；Dai等人，2019年；Gootenberg等人，2017年）。像Cas12a、Cas13和Cas14这样的酶的辅助核酸酶活性使得核酸的检测具有高度特异性和放大效果，使这些系统成为快速诊断的理想选择，并为实现快速、经济且便携的诊断方法铺平了道路，符合ASSURED（经济、灵敏、特异、用户友好、快速、稳健、无需设备、易于实施）的现场检测标准（Chi等人，2022年；Del Giovane等人，2024年；Land等人，2018年；Najjar等人，2022年）。近年来，基于CRISPR/Cas的生物传感器已与多种转导技术（荧光、比色、电化学和发光）结合，表现出高度的适应性和模块化（Bonini等人，2021a年；Carota等人，2024年；Ki等人，2022年；Zhou等人，2022年）。与等温扩增方法（如重组酶聚合酶扩增（RPA）或环介导扩增（LAMP）的结合进一步提高了检测限，实现了阿托摩尔级别的灵敏度，便于其在诊断中的应用（Tang等人，2022年；Wu等人，2021年；Yang等人，2024年；Zhang等人，2022年）。尽管取得了显著进展，但许多基于荧光的CRISPR检测方法仍依赖于合成荧光染料-淬灭剂探针、昂贵的试剂或多步骤流程，这些因素限制了其可扩展性和成本效益。为简化信号读取，研究人员开发了比色和基于纸片的检测方法（X. Chen等人，2021年；Zhuang等人，2022年），但这些方法往往会牺牲灵敏度或需要酶的预激活步骤。因此，开发简单、无需试剂且成本低廉的光学报告基因仍是实现易于使用和现场应用的CRISPR基诊断的关键步骤。在这方面，将可编程的CRISPR/Cas系统与基于DNA模板的铜纳米簇（CuNCs）结合，为真正的一锅法、低成本和快速病原体检测及其他临床相关应用带来了希望。
在本研究中，我们系统地筛选了一组DNA序列，以确定最佳的CuNCs形成模板，并开发了一种完全基于一锅法的细菌DNA检测荧光检测方法。选择大肠杆菌作为模型生物，通过基于CRISPR/Cas12a的平台实现检测，该平台在识别目标序列后会被激活。Cas12a介导的对合理设计的茎环模板的切割会干扰CuNCs的形成，从而在不到1小时内产生明显的荧光开关响应。通过改变DNA模板的结构和浓度优化了检测方法，并通过实验设计（DoE）方法进一步优化，以确定关键参数的相互作用并指导未来的改进。最终开发的CRISPR–CuNCs检测方法达到了皮摩尔级别的灵敏度，在人血清中有效运行，并成功检测到了临床分离株中的DNA。总体而言，这项工作介绍了一种新型的、低成本且灵敏的检测策略，将可编程的CRISPR识别技术与基于DNA模板的铜纳米簇相结合，为病原体检测提供了一个有前景的平台。
材料
三氢氯化物（Tris-HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaCl、MgCl2、3-(N-吗啉)丙磺酸（MOPS）和无RNase的水由Sigma-Aldrich（意大利米兰）提供。L-抗坏血酸钠由Tokyo Chemical Industry（TCI Europe N.V.，比利时Zwijndrecht）提供。五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O）由Carlo Erba试剂公司（意大利Cornaredo）提供。所有冻干的HPLC级寡核苷酸（DNA-铜纳米簇模板序列）也由该公司提供。
检测原理
该检测方法结合了Cas12a/gRNA复合物的高特异性和切割活性，以及基于特定DNA序列构建的铜纳米簇（CuNCs）产生的强荧光。当识别到细菌目标DNA时，Cas12a/gRNA复合物被激活并切割用于支持CuNCs形成的单链DNA报告基因。这种切割破坏了模板DNA，导致荧光显著减弱（开关机制）。
结论
本研究证明，基于DNA模板的铜纳米簇（CuNCs）是高效的CRISPR基核酸检测荧光报告基因。通过选择能够生成明亮CuNCs的茎环DNA模板，我们建立了一种一锅法检测方法，其中Cas12a的激活会导致荧光几乎完全消失，从而实现灵敏的目标识别，而无需核酸扩增。CuNCs表现出稳定且可调的荧光特性，使得检测结果更加可靠。
CRediT作者贡献声明
A.G. Carota：概念构思、研究设计、方法学研究、验证、数据可视化、初稿撰写。F. Spiaggia：概念构思、数据分析、验证、初稿撰写。N. Poma：研究设计、方法学研究、撰写、审稿与编辑。P. Palladino：撰写、审稿与编辑。D. Cuffaro：撰写、审稿与编辑。F. Vivaldi：项目管理、监督、撰写、审稿与编辑。C. Ravelet：资金获取、撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
AGC项目得到了GORU-IEIIT - BIOESAL项目（DIT.AD009.167）的支持，该项目由意大利国家研究委员会（CNR-IEIIT）的电子与信息通信工程研究所资助。作者FS、CR和MM感谢Franco-Italienne/Italo-Francese大学在2023年Vinci计划（项目C3-161）下提供的联合博士奖学金支持，该项目名为“利用基于铜的生物传感器检测临床生物标志物”。
