基于改良的无细胞翻译系统开发了一种立足点开关检测平台，该平台能够特异性区分冠状病毒性支气管炎病毒的基因型，并灵敏地检测限域在韧皮部的细菌——亚洲 Liberibacter candidatus

高效细胞无细胞系统与LAMP技术联用实现病原体高分辨率检测

　　

马亚萍|刘定祥

中国肇庆市岭南现代农业科学技术广东省实验室肇庆分中心，526238

摘要

高分辨率和超灵敏的核酸诊断技术是识别和控制动植物病原体的重要工具。基于无细胞系统（CFS）的toehold switch诊断技术具有快速响应、可编程性、多功能性和正交性，因此在应对动植物疫情方面具有巨大潜力。然而，toehold switch系统的信号放大性能和快速原型制作能力受到CFS对线性DNA表达效率的限制。在这项研究中，我们报道了一种CFS系统的制备方法，该方法能够从包含toehold switch系统的线性和环形DNA模板中高效表达LacZ蛋白，该方法利用了细菌细胞中的λ噬菌体溶菌程序，并抑制或消除了外切酶活性。通过保留传感器的模块化优势，并通过与Loop介导等温扩增（LAMP）技术结合来扩展其分子可编程性，开发了一种基于纸片的无细胞传感器诊断平台，能够以单碱基分辨率对三种传染性支气管炎病毒（IBV）菌株进行基因分型。此外，还证明了该系统在检测受韧皮部限菌Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）感染的柑橘叶片方面的适用性。该平台结合了CFS的高表达活性、线性DNA的稳定性、分子传感器的强特异性和高灵敏度，以及基于纸片材料的易于储存、分发和比色读数的优点，为资源有限地区的动植物病原体检测提供了广泛的应用前景。

引言

合成生物学是一门新兴学科，在应对动植物疫情方面具有巨大潜力。在过去十年中，已经开发出多种基于DNA或RNA的无细胞传感器系统（Bains等人，2023年；Diaz等人，2022年；Jung等人，2020年；Tabuchi和Yokobayashi，2022年）。Switch RNA是一种可编程的翻译调控因子，通过与效应触发RNA结合来控制基因翻译。在没有触发RNA的情况下，Switch RNA中的核糖体结合位点（RBS）和翻译起始密码子（AUG）被发夹结构所隔离，从而阻止核糖体识别并抑制报告基因的翻译。然而，当触发RNA与toehold序列识别并互补配对时，Switch RNA中会发生链置换反应，解开发夹结构，使被隔离的RBS和AUG暴露出来，使核糖体能够结合到RBS并激活报告基因的翻译。基于RNA的无细胞传感器在检测传染性病原体和人类健康生物标志物方面发挥了关键作用，因为它们满足了快速响应、易于实施、低成本开发和现场部署的核酸检测需求。例如葡萄糖传感器和特定埃博拉病毒传感器（Pardee等人，2014年）、肠道细菌和宿主生物标志物的物种特异性检测（Takahashi等人，2018年）、呼吸道合胞病毒A亚群（RSVA）和B亚群（RSVB）的快速检测和区分（Cao等人，2021年），以及黄瓜花叶病毒的诊断（Verosloff等人，2019年）。

传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒IBV引起的急性、高度传染性的病毒性疾病，影响全球的商业鸡群。由于其高突变率、基因重组和宿主选择压力，IBV迅速进化，产生越来越多的基因型和血清型。然而，由一种IBV血清型诱导的保护性免疫通常对其他血清型的感染提供较差的交叉保护（de Wit等人，2021年；Ghetas，2021年；Kariithi等人，2022年；Raj和Jones，1997年）。这导致商业鸡群中频繁爆发IBV感染，给家禽产业造成重大经济损失（Rafique等人，2024年）。因此，迫切需要开发高分辨率的基因分型诊断技术来识别和区分IBV基因型，为针对保护性免疫疫苗的研究奠定基础。

黄龙病（HLB），也称为柑橘绿病，是一种由韧皮部限菌‘CLas’引起的柑橘植物的高度侵袭性和广泛分布的疾病（Bové，2006年）。近年来，它已成为柑橘产业的主要威胁。HLB具有长的无症状潜伏期，使得疾病的早期检测具有挑战性。一旦症状出现，疾病就无法治疗，目前HLB的最佳管理策略是使用农药控制病原体并移除受影响的树木（Zhou，2020年）。这种方法阻碍了环境和经济可持续的柑橘种植。因此，在无症状潜伏期准确及时地诊断CLas对于检测和控制HLB至关重要。

尽管CFS已成功用于体外检测各种目标核酸，但它们仍面临某些关键限制。具体来说，相对较低的CFS表达活性和较差的线性DNA保护效果可能限制其在信号放大和快速原型制作能力方面的表现（Batista等人，2022年；Pardee等人，2014年；Zawada和Swartz，2006年），可能导致CFS检测实验中出现矛盾或无效的结果。在这项研究中，我们报道了一种基于λ噬菌体溶菌程序的CFS的开发，该程序具有抑制或缺失的外切酶活性。通过将toehold switch整合到CFS中，开发了一种用于检测动植物病原体的基于纸片的平台。这种基于纸片的无细胞传感器诊断平台结合了CFS的高表达活性和线性DNA稳定性、分子传感器的强特异性和高灵敏度、基于纸片材料的易于储存和分发，以及比色结果的优势，使其在资源有限的环境和即时检测（POCT）场景中具有显著的应用潜力。

部分内容

通过冻融法制备大肠杆菌提取物用于自溶液

CFS的反应成分包括大肠杆菌提取物、预混液、含有目标基因序列的DNA/RNA模板和ddH₂O，制备方案改编自（Didovyk等人，2017年）并进行了修改。简而言之，工程菌株BL21(DE3)-Gold-dLac（携带质粒AD-AmpRPro-GamS和AD-LyseR）或BL21(DE3)-Gold-dLac-dRecBCD:LyseR在含有适当抗生素的2×YTPG培养基中培养。当细胞密度达到OD600为0.6时，加入IPTG

基于表达GamS和LysR基因的改良大肠杆菌的CFS优化

使用CFS从大肠杆菌合成依赖DNA的蛋白质需要制备去除遗传物质和膜的细胞提取物以及预混液。通常，源菌株已经经过基因组优化以减少蛋白酶和核酸酶活性，通过均质化、超声处理或冻融循环（Kim和Choi，2001年；Michel-Reydellet等人，2004年）来实现裂解，以获得功能性提取物。本研究采用的关键策略是抑制

结论

总之，我们开发了一种遗传稳定、线性DNA稳定且表达能力强的CFS，来源于大肠杆菌。基于该系统，通过将CFS与toehold switch结合，开发了一种基于纸片的无细胞传感器诊断平台。在这个平台上，目标分子的存在激活toehold switch，产生比色输出。通过保留无细胞传感器的模块化优势，并通过与LAMP结合进一步扩展分子可编程性

CRediT作者贡献声明

马亚萍：撰写——原始草稿、验证、软件、方法学、数据分析、概念化。刘定祥：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念化

未引用参考文献

Bains等人，2023年。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。所描述的工作尚未在其他地方提交发表，无论是全部还是部分。所有作者都做出了重要贡献，所有作者均同意手稿的内容。

致谢

这项工作部分得到了国家自然科学基金（资助编号32170152）、广东省基础与应用基础研究基金（资助编号2024A1515012930）、广东省实验室研究与创新计划（资助编号XJGDL2022001）、肇庆西江创新团队基金（资助编号P20211154-0201和P20211154-0202）的支持。