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Metformin通过SLC5A11-AMPK-PD-L1轴抑制肿瘤免疫抑制并增强PD-1阻断疗法的协同效应
马亚睿|王雪|魏哲文|张琪|袁芳清|徐春贵|刘长|王晓冰|李琳|焦宇辰
中国科学院医学科学院/北京协和医学院国家癌症中心/国家癌症临床研究中心/肿瘤医院，北京100021
摘要
二甲双胍在癌症治疗中表现出免疫调节作用，但其潜在机制仍不明确。通过全基因组CRISPR筛选，我们发现SLC5A11是二甲双胍敏感性的关键介导因子。分子对接和动力学模拟显示，二甲双胍直接与SLC5A11结合，该结合位点包含Asn78和Glu102残基。二甲双胍通过SLC5A11依赖性激活AMPK，进而下调JAK2-STAT1-IRF1通路，从而在多种癌症模型中抑制PD-L1的表达。SLC5A11敲除会消除这些效应，而重新引入SLC5A11则可恢复二甲双胍的疗效。在肺癌和胰腺癌的共基因小鼠模型中，将二甲双胍与抗PD-1疗法联合使用可产生协同抗肿瘤效果，增强T细胞浸润，并提高免疫治疗的疗效。二甲双胍预处理显著增强了PBMC对肿瘤细胞的细胞毒性以及体外共培养系统中患者来源的肿瘤类器官的杀伤作用。我们的发现确立了SLC5A11-AMPK-PD-L1轴作为二甲双胍与肿瘤免疫联系的新机制，为将二甲双胍与免疫检查点抑制剂联合使用提供了分子依据。
引言
二甲双胍作为一线抗糖尿病药物，已被证明是一种有前景的抗癌剂。流行病学研究表明，使用二甲双胍与多种恶性肿瘤的发病率降低和预后改善有关1, 2。除了通过AMPK激活和代谢重编程的直接抗肿瘤作用外3，最新证据还揭示了二甲双胍的显著免疫调节作用。二甲双胍能增强CD8+ T淋巴细胞的浸润和功能，同时抑制调节性T细胞和髓系来源的抑制细胞4, 5, 6, 7，逆转T细胞耗竭8, 9，并在临床前研究中改善对免疫检查点抑制剂的反应5, 10。然而，这些免疫调节作用的分子机制尚未完全阐明。
目前尚不清楚二甲双胍如何与细胞机制相互作用以调节肿瘤免疫。虽然有机阳离子转运蛋白介导二甲双胍的吸收11，但其对免疫检查点表达的具体分子调控机制仍不清楚。最近的研究强调了溶质转运蛋白（SLC）在癌症代谢和免疫中的重要性12, 13, 14, 15, 16。其中，SLC5A11是一种钠/葡萄糖共转运蛋白，参与代谢稳态和肿瘤进展14，但其在免疫调节中的作用尚未探索。鉴于二甲双胍对细胞代谢的影响以及其调节PD-L1表达的能力17, 18，我们推测特定的代谢转运蛋白可能介导其免疫调节作用。
在本研究中，我们采用无偏的全基因组CRISPR筛选方法来鉴定二甲双胍在癌细胞中的细胞毒性分子决定因素。这一方法意外地发现SLC5A11是二甲双胍诱导的细胞毒性和免疫调节的关键介导因子。我们证明二甲双胍直接与SLC5A11结合，并通过一个新的AMPK-JAK2-STAT1-IRF1信号通路抑制PD-L1的表达。此外，在临床前模型中，将二甲双胍与免疫检查点阻断联合使用可产生协同抗肿瘤效果，包括对免疫治疗耐药的胰腺癌。这些发现表明SLC5A11是二甲双胍的一个新靶点，并为合理结合代谢干预和癌症免疫治疗提供了分子框架。
CRISPR-Cas9筛选发现SLC5A11是二甲双胍细胞毒性的关键介导因子
鉴于二甲双胍的抗癌作用已有明确证据，但其分子靶点尚未完全明确，我们系统地鉴定了对二甲双胍诱导的细胞毒性至关重要的基因。我们使用包含76,441个sgRNA的Brunello文库，在U251-MG胶质母细胞瘤细胞中对19,114个基因进行了全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。经过慢病毒转导和嘌呤霉素筛选后，细胞持续接受5 mM浓度的二甲双胍处理
讨论
越来越多的证据表明二甲双胍具有潜在的抗肿瘤作用，并在多种实体瘤中表现出免疫调节效果5, 22, 23。在本研究中，我们通过鉴定SLC5A11为二甲双胍免疫调节作用的关键介导因子，揭示了一种新的作用机制。我们的综合分析显示，二甲双胍直接与SLC5A11结合，通过AMPK激活触发信号级联反应
材料
二甲双胍（HY-B0627）、AICAR（HY-13417）和Dorsomorphin（HY-13418A）购自MedChemExpress（北京，中国）。CY5-Metformin（Q-0831396）购自西安瑞禧生物科技有限公司（西安，中国）。InVivoMAb抗小鼠PD-1（BE0273）购自BioXCell（美国）。
细胞系
U251-MG细胞（来自中国北京的国家细胞系资源库），K210细胞（从C57BL/6J LSL-Kras(G12D)的自发性胰腺导管腺癌中分离获得）；Trp53
CRediT作者贡献声明
魏哲文：撰写——初稿、验证、资源准备、方法学设计、实验实施。王雪：撰写——初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。马亚睿：审稿与编辑、撰写——初稿、实验监督、方法学设计、实验实施、资金获取、数据整理、概念构思。焦宇辰：审稿与编辑、实验监督、项目管理、资金获取、概念构思。李琳：撰写——
伦理声明
所有动物实验均获得中国科学院肿瘤医院动物伦理委员会的批准并按照其规定进行（批准号：NCC2025A086）。本研究中使用的PBMC来自上海 Mile-stone 生物科技有限公司（上海）。所有涉及人类PBMC的程序均获得上海 Liquan 医院的伦理委员会批准（批准号：X-LQ-SHSLT-23-10-001）。患者来源的肿瘤类器官实验也获得了伦理委员会的批准
利益冲突声明
作者声明在准备和提交本手稿的过程中，不存在可能影响手稿公正性或客观性的利益冲突。
利益冲突声明
作者声明在撰写本文过程中，不存在任何可能影响本文结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本项目得到了国家自然科学基金（22193034、82372696、82203229、82203349、8230294）、CAMS医学科学创新基金（2021-I2M-1-067、2022-I2M-1-009）、CAST青年精英科学家资助计划（2023QNRC001）、中国博士后科学基金（2023M730326、2024T170073）、中国博士后科学基金的博士后奖学金计划（GZB20230082）以及中央高校专项研究基金的支持
