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椎间盘退行化（IVDD）中电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）通过介导线粒体DNA（mtDNA）释放激活TLR9-NF-κB-NLRP3吡罗妥osis通路，本研究首次证实抑制VDAC1可缓解氧化应激诱导的NPC线粒体功能障碍及ivdd进展，为靶向治疗提供新思路。
胡同龙|严淼恒|陈阳阳|陈松峰|宋宗冕|景晓波|胡斌武|刘洪健
郑州大学第一附属医院骨科，中国郑州450052
摘要
程序性细胞死亡，特别是由炎症信号通路介导的焦亡，在椎间盘退变（IVDD）的发病机制中起着关键作用。然而，IVDD中焦亡和炎症的调控机制仍不明确。电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是一种重要的线粒体蛋白，在炎症刺激下会形成寡聚结构，导致线粒体DNA（mtDNA）释放到细胞质和细胞外空间。这会触发炎症级联反应并激活焦亡信号通路，但其生理作用和在IVDD中的调控机制仍不清楚。在本研究中，我们发现VDAC1在退化的髓核组织中的表达增加，氧化应激可诱导NPC中VDAC1的表达和寡聚化。通过特异性抑制剂NSC15364抑制VDAC1或通过特异性siRNA下调VDAC1的表达可以减轻NPC的线粒体功能障碍和焦亡。从机制上讲，我们证明了抑制VDAC1可以减少mtDNA的细胞质泄漏，从而阻断TLR9信号通路，最终在体外和体内减轻NPC的焦亡。我们的结果首次证明VDAC1-mtDNA-TLR9信号通路可能是治疗IVDD的新靶点。
引言
腰痛（LBP）具有高发病率和致残率、年轻发病年龄以及高昂的医疗成本，已成为全球主要的健康挑战。椎间盘退变（IVDD）是腰痛的主要原因。阐明IVDD的发病机制可能会为腰痛提供有希望的治疗靶点。新兴证据表明，髓核细胞（NPCs）的程序性细胞死亡在IVDD的发病机制中起着重要作用，但其具体机制尚未完全阐明[1]。
电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是线粒体外膜上最丰富的蛋白质。在生理条件下，VDAC1以单体和二聚体的形式存在动态平衡。当细胞遇到不良刺激（如炎症刺激）时，VDAC1的过表达会促使平衡向寡聚体形成转变，进而形成过渡孔，增加线粒体外膜的通透性。作为线粒体门控蛋白，VDAC1可以调节线粒体DNA（mtDNA）的释放、Ca2+信号传导、三羧酸（TCA）循环、糖酵解、脂质代谢、线粒体自噬和细胞命运[2]。VDAC1在许多疾病（包括癌症、糖尿病、神经退行性疾病、肾脏疾病、衰老和类狼疮疾病）的发病机制中的作用已有充分记录[3]，[4]。然而，VDAC1在IVDD中的具体功能尚未完全解析。
线粒体功能障碍在IVDD中起着重要作用[5]，[6]。由于线粒体的内共生起源，受损线粒体释放的因子会被视为外来物质，最终引发细胞死亡[7]。mtDNA在结构上类似于细菌DNA（富含CpG基序），是诱导细胞死亡的主要因素之一。一旦释放到细胞质中，mtDNA可以激活多种模式识别受体和先天免疫反应，导致强烈的I型干扰素反应和细胞死亡[8]，[9]。先前的研究表明，通过线粒体通透性过渡孔释放到细胞质的mtDNA可以通过cGAS-STING-NLRP3轴诱导NPC的焦亡[10]。此外，mtDNA还通过激活TLR9-NF-κB-NLRP3轴诱导NPC的焦亡[11]。
TLR9是一种重要的模式识别受体，能够感知mtDNA[8]。TLR9参与多种疾病的发病机制，包括类风湿性关节炎、心血管疾病、糖尿病等[12]。尽管之前的研究已经揭示了TLR9-NF-κB-NLRP3轴的作用，但其上游调控因子仍不清楚。在本研究中，我们发现氧化应激会升高VDAC1的表达和寡聚化。抑制VDAC1可以减少mtDNA的细胞质泄漏，并通过VDAC1-mtDNA-TLR9通路减轻NPC的焦亡。此外，我们的体内实验证明了抑制VDAC1对IVDD的治疗效果。
实验部分
人类髓核组织样本的收集
该实验方案已获得华中科技大学同济医学院医学伦理委员会的批准，所有患者均签署了组织捐赠的知情同意书。人类髓核（NP）样本来自接受腰椎手术的患者，这些患者患有特发性脊柱侧弯、腰椎爆裂性骨折、脊柱狭窄或腰椎间盘突出。根据Pfirrmann MRI分级系统，样本被分为两组：非退化组：
氧化应激诱导VDAC1的表达和激活
我们首先评估了人类NP样本中VDAC1的表达情况。免疫组化染色显示，与正常组相比，IVDD组中VDAC1的表达显著增加，表明VDAC1可能参与了IVDD的发病机制（补充图1A）。然后我们检测了暴露于氧化应激下的NPC中VDAC1的表达情况。PCR结果显示TBHP增加了VDAC1的表达（图1A）。相应地，Western blot结果也显示了类似的趋势
讨论
线粒体功能障碍在IVDD的发病机制中起着重要作用，但其确切机制仍需进一步阐明。线粒体外膜蛋白VDAC1在调节线粒体功能和细胞命运中起着关键作用。然而，其在IVDD中的功能尚不清楚。在本研究中，我们发现氧化应激会诱导VDAC1的表达和激活。抑制VDAC1可以减轻线粒体功能障碍和mtDNA的细胞质泄漏
作者贡献声明
胡同龙：撰写初稿、项目管理、方法学设计、实验实施。严淼恒：软件使用、资源协调。陈阳阳：数据分析、概念化设计。陈松峰：资源获取、项目协调。宋宗冕：数据管理、概念化设计。景晓波：结果验证、数据分析。胡斌武：撰写修订、数据可视化、资源管理。刘洪健：数据可视化、实验监督、资金筹措。
伦理声明
该人体研究遵循赫尔辛基宣言进行，并获得了华中科技大学同济医学院医学伦理委员会的批准（2017S333，2017年12月），所有患者均签署了组织捐赠的知情同意书。动物实验方案已获得华中科技大学同济医学院动物伦理委员会的批准（2023-D15，2023年5月）。所有动物实验均符合相关伦理要求。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82472510、82372472、82172484、82402872）和河南省医学科学技术研究项目（项目编号：LHGJ20240939）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢郑州大学第一附属医院的转化医学中心提供的技术支持，并感谢审稿人对本文提出的宝贵意见。
