一种集治疗与预防功能于一体的核碱基脂质纳米疫苗，结合STING通路激动剂（2'3'-cGAMP），用于防止肿瘤复发和转移

本研究开发了一种结合抗肿瘤、抗转移及抗复发功能的核酸脂质纳米疫苗2’3’-cGAMP@DTL，通过激活STING通路抑制原发肿瘤及术后复发，减少转移风险，为术后肿瘤防治提供新策略。

　　

董文培|常春|徐凌云|江涛|张贵生|陈长波

河南师范大学化学与化学工程学院，中国河南省新乡市453007

摘要

开发能够同时治疗肿瘤并有效预防肿瘤复发和转移的癌症纳米疫苗仍然面临重大挑战。在这项研究中，我们设计了一种结合了抗肿瘤、抗转移和抗复发特性的核碱基脂质体疫苗。该纳米疫苗2'3'-cGAMP@DTL采用了核碱基-脂质负载的免疫佐剂2'3'-cGAMP。一方面，2'3'-cGAMP@DTL通过刺激干扰素基因刺激物（STING）通路激活先天免疫系统，从而抑制肿瘤增殖；另一方面，2'3'-cGAMP@DTL增强了STING通路的激活，促进了肿瘤转移和术后模型中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的增殖，并抑制了原发肿瘤和术后肿瘤的生长。总之，纳米疫苗2'3'-cGAMP@DTL在抑制肿瘤生长和减少术后肿瘤复发和转移方面表现出显著疗效，为肿瘤患者提供了直接有效的治疗策略。

引言

手术仍然是治疗实体瘤的主要方法[1]、[2]、[3]。尽管外科技术和设备不断进步和完善，但仍有30-40%的患者在术后五年内出现肿瘤复发或转移[4]、[5]、[6]。在实体瘤的外科干预中，残留的肿瘤细胞或循环肿瘤细胞可能导致复发和转移。外科方法往往无法抑制远处肿瘤的生长，且在减少转移方面通常效果不佳[7]、[8]。因此，迫切需要设计新的治疗策略，以系统地抑制肿瘤复发和转移。目前，化疗是预防复发和转移的主要临床方法，但它通过外源性机制消灭转移性肿瘤细胞，但经常对体内正常细胞造成显著伤害[9]、[10]。相比之下，肿瘤免疫疗法通过激活或增强患者的免疫系统来靶向和消除肿瘤细胞，提供了一种替代方案[11]、[12]、[13]。肿瘤疫苗是一种能够引发特异性和持续抗肿瘤免疫反应的治疗手段，具有显著提升癌症治疗效果的潜力[14]、[15]、[16]。本研究旨在寻找一种新型免疫疗法，既能避免手术切除，又能有效预防肿瘤复发和转移。通过将抗肿瘤、抗转移和抗复发功能整合到一种疫苗中，这种方法有望成为未来癌症治疗的主要策略。

佐剂在增强免疫反应中起着关键作用。在肿瘤疫苗的背景下，佐剂不仅激活先天免疫系统，促进促炎细胞因子的分泌，还能促进CD4⁺和CD8⁺ T细胞的启动和激活[17]、[18]、[19]。新型免疫佐剂的研发是提高肿瘤疫苗疗效的有效策略。其中，STING信号通路的激动剂尤其具有前景[20]、[21]。STING激动剂（2'3'-cGAMP）在抗原呈递细胞中激活STING通路，诱导I型干扰素（IFN-I）的分泌，从而促进T细胞的增殖和激活[22]、[23]、[24]。然而，2'3'-cGAMP作为一种天然负电荷的STING激动剂，在作为肿瘤疫苗中的免疫佐剂使用时存在递送效率不足和体内不稳定的问题[25]、[26]、[27]、[28]。因此，开发新一代肿瘤疫苗，以增强免疫佐剂2'3'-cGAMP的细胞质递送并有效激活STING信号通路，对于推进肿瘤疫苗治疗至关重要。

为了提高免疫佐剂2'3'-cGAMP在肿瘤细胞内的递送和积累效果，并有效激活免疫系统，本研究开发了一种多功能纳米疫苗2'3'-cGAMP@DTL（图1）。2'3'-cGAMP@DTL由核碱基-脂质和免疫佐剂2'3'-cGAMP组成，兼具治疗和预防功能。核碱基-脂质是通过将胸腺嘧啶与脂质共价结合制备的。核碱基-脂质中的胸腺嘧啶通过π-π堆叠、静电相互作用和碱基互补配对等方式与2'3'-cGAMP结合，在缓冲液中形成肿瘤纳米疫苗。因此，核碱基-脂质纳米疫苗2'3'-cGAMP@DTL增强了2'3'-cGAMP在肿瘤细胞和免疫细胞内的积累。在用于体内疫苗接种研究以及单侧和双侧肿瘤模型和术后肿瘤模型的治疗之前，2'3'-cGAMP@DTL经过了全面表征。注射的2'3'-cGAMP@DTL能够在肿瘤微环境中积累并释放2'3'-cGAMP，激活肿瘤组织中的cGAS/STING通路，从而诱导肿瘤特异性免疫反应。因此，2'3'-cGAMP@DTL促进了肿瘤浸润T细胞在肿瘤部位的积累，最终抑制了肿瘤生长并降低了肿瘤复发或转移的可能性。纳米疫苗有望为实体瘤的免疫治疗提供新的见解和方法。

纳米疫苗（2'3'-cGAMP@DTL）的制备

核碱基-脂质DTL的合成过程见补充信息SI.490：将μg的核碱基脂质DTL溶解在1 mL氯仿中，然后用旋转蒸发器去除有机溶剂，使液体在瓶底形成薄膜，并在真空下过夜干燥。室温下向薄膜中加入85.03 μg的2'3'-cGAMP和1000 μL pH = 7.2的PBS溶液。将脂质混合物在50℃下超声处理30分钟，形成2'3'-cGAMP@DTL。最终得到2'3'-cGAMP@DTL制剂。

核碱基-脂质DTL的合成

核碱基-脂质DTL的设计基于沃森-克里克碱基互补配对原理。在两亲性脂质结构中，我们设计了引入与2'3'-cGAMP中的碱基配对的胸腺嘧啶。DTL不仅可以通过π-π相互作用结合，还可以通过碱基相互作用有效包含2'3'-cGAMP。核碱基-脂质DTL的合成方法见示意图S1。制备的DTL通过¹H核磁共振（NMR）、¹³C NMR等手段进行了表征。

结论

总之，我们报道了一种利用核碱基-脂质作为载体用于肿瘤治疗和预防的创新纳米疫苗。该纳米疫苗在肿瘤治疗和抑制术后肿瘤转移及复发方面显示出潜力。核碱基-脂质通过自组装封装了免疫佐剂2′3′-cGAMP，增强了STING通路的激活，促进了T细胞的分化，并促进了CD4⁺和CD8⁺ T细胞的增殖。

数据可用性

数据可应要求提供。

作者贡献声明

常春：方法学研究。徐凌云：撰写初稿、验证、方法学研究。董文培：撰写、审稿与编辑、方法学研究。陈长波：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。江涛：方法学研究。张贵生：撰写、审稿与编辑、监督、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究部分得到了国家自然科学基金（编号22277022）、河南省高等教育机构重点研究计划（编号25B350005）以及河南师范大学博士后启动基金（编号5101039470708）的支持。