综述：膜蛋白巨复合体的原位结构研究

膜蛋白超复合体原位高分辨率结构研究进展：聚焦冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）技术突破与功能解析，揭示空间组织与生理功能关联，探讨技术局限及未来方向。

　　

孙珊|崔森芳

清华大学生命科学学院生物结构前沿研究中心膜生物学国家重点实验室，北京 100084，中国

膜蛋白复合体对细胞功能至关重要，这些功能既依赖于组成蛋白的结构，也依赖于它们在天然膜内的相互作用。虽然体外方法已经成功获得了单个蛋白和亚复合体的高分辨率结构，但这些方法通常需要使用去污剂进行提取和广泛的纯化，这可能会破坏天然膜环境并可能改变超分子结构。因此，原位结构生物学作为一种有效策略应运而生，它可以直接在生理环境中观察大分子机器。随着技术的不断进步，最近的一些研究已经获得了大型蛋白复合体的高分辨率甚至接近原子级别的原位结构。本综述重点介绍了最近关于膜蛋白巨复合体的原位高分辨率研究，强调了关键技术创新、结构见解以及该领域仍存在的挑战和机遇。

引言

膜蛋白巨复合体，如呼吸链超复合体、光合装置和ATP合成酶寡聚体，在细胞能量转换、信号转导、物质转运等方面起着核心作用[1, 2, 3]。它们的活性不仅取决于组成蛋白的内在结构，还取决于它们在天然磷脂膜内的相互作用。这种高级别组织结构调控电子流动、质子泵送和膜形状等，从而支持细胞生命过程[4, 5, 6, 7, 8]。传统上，结构生物学依赖于体外技术（如X射线晶体学和单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）来获得从膜中分离出来的单个蛋白和复合体的高分辨率结构[9, 10, 11, 12, 13]。然而，这些方法通常需要使用去污剂进行提取、广泛的纯化或体外重组，从而消除了天然膜环境，可能改变了超分子组装的功能结构[14, 15, 16]。

原位结构生物学作为一种成功策略，通过直接在生理环境中观察大分子机器来克服这些限制[17]。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术的发展，结合冷冻聚焦离子束（FIB）铣削和亚图平均（STA）技术，使研究人员能够以纳米到亚纳米的分辨率揭示膜蛋白巨复合体的天然结构[13,18, 19, 20, 21, 22]。这些进展提供了具有深远生物学意义的结构见解，揭示了巨复合体的空间结构与其生理功能之间的直接关联——例如线粒体呼吸链超复合体对于有效的电子传输，以及光系统组装对于能量转移的调节[23, ??24, ??25, ??26, ??27]。技术的持续创新进一步提高了cryo-ET的分辨率，并扩展了其应用范围，为将高分辨率结构与功能动态结合起来进行综合研究铺平了道路。

在这里，我们重点介绍了最近关于膜蛋白巨复合体的原位高分辨率结构研究，强调了使这些研究成为可能的技术进步以及它们所提供的结构见解。我们还讨论了该领域当前面临的挑战和未来的发展机遇。

技术进展

实现膜蛋白巨复合体高分辨率原位研究的技术进步

直到最近，细胞膜蛋白的原位冷冻电子断层扫描分辨率还很少超过15–20 ?，这在由断层扫描提供的生理信息与体外冷冻电子显微镜单粒子分析（SPA）所能获得的原子细节之间形成了差距。然而，在过去的四年中，出现了决定性的突破：可以直接在天然细胞器或完整细胞内对大型膜蛋白巨复合体进行高分辨率甚至接近原子级别的重建[??24, ??25, ??26, ??27, ?28]

膜蛋白巨复合体的结构见解

原位冷冻电子断层扫描能够直接在生理环境中观察膜蛋白巨复合体，揭示超分子结构如何控制其功能。与体外单粒子重建不同，这些分析保留了脂质环境和天然相互作用。这里我们重点介绍了两个研究较为深入的系统——光合装置和呼吸链超复合体——在这些系统中，接近原子级别的原位结构提供了重要的机制见解（图1）。

当前挑战与未来方向

尽管取得了显著进展，原位冷冻电子显微镜仍面临一些重大挑战，这些挑战限制了其广泛应用。迄今为止，只有少数具有较大尺寸、高拷贝数、结构刚性或有序排列的体系才能实现接近原子级别的分辨率，这些特性有助于增强信号并便于平均化。许多生物学上重要的复合体分布稀疏、构象灵活，或者嵌入复杂的细胞环境中，这使得它们更难以解析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

由于篇幅限制，我们未能引用某些科学家的工作。本研究得到了国家自然科学基金（S.-F.S.获得的项目编号32241030，S.S.获得的项目编号92254306）的支持。