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本研究采用单细胞测序技术，构建了4周和8周妊娠期驴胚胎性腺的单细胞转录组图谱，解析了性腺发育过程中细胞异质性和动态变化规律，发现DDX4、DAZL等生殖相关基因表达差异，并揭示TGF-β、BMP等信号通路在性腺分化中的调控作用。研究证实卵巢上皮细胞在早期妊娠阶段可分化为颗粒细胞，为优化繁殖技术提供了理论依据。
作者：Yadan Jin、Huajie Zhang、Ruixue Ma、Hongli Song、Fangdi Zhang、Kaixuan Wang、Haiwei He、Yujiang Sun、Guoliang Zhang
单位：青岛农业大学动物科学技术学院，中国山东省青岛市，266109
摘要
在驴的繁殖过程中，较长的繁殖周期是导致其繁殖率较低的关键因素。性腺发育是一个高度复杂的生物过程，涉及性别决定以及随后向卵巢成熟的过程。目前，关于驴卵巢发育的机制仍知之甚少。为了解决这一难题，我们构建了怀孕4周和8周时驴胚胎性腺的单细胞转录组图谱，从而识别出参与的主要细胞类型。在发育过程中，卵巢的形态发生了显著变化，逐渐从最初的长圆柱形转变为椭圆形。值得注意的是，两种卵巢组织中的细胞类型组成存在差异。此外，我们观察到与生殖细胞相关的基因（包括DDX4、DAZL、POU5F1和NANOG）存在变异，这些基因调控着两种组织中生殖细胞的动态分化。细胞通讯相互作用分析揭示了TGF-β、AMH、BMP和GDF信号网络在与胚胎发育相关方面的差异。进一步研究了两种组织中上皮细胞的功能差异，并评估了与颗粒细胞相关的基因表达水平，结果表明颗粒细胞可能起源于妊娠早期的卵巢上皮细胞。总体而言，本研究阐明了妊娠早期卵巢组织的分子特征，为进一步研究与卵巢发育相关的遗传标记和基因调控网络提供了重要依据。这可能为生殖障碍和遗传育种研究提供有价值的见解。
引言
在漫长的历史进程中，驴作为重要的家畜，在农业生产、运输等多个领域发挥了独特的作用。然而，随着工业革命的推进，驴的传统角色逐渐消失[1]。如今，随着人们对驴产品的关注度不断提高，驴养殖业进入了新的发展阶段。驴肉因其丰富的营养成分（富含多不饱和脂肪酸）和独特的风味，逐渐成为健康饮食的新选择[2][3][4]。驴奶中的乳糖、脂质和蛋白质成分与母乳的相似度超过90%[5]。因此，对于牛奶过敏的人来说，驴奶是牛奶的理想替代品，可以满足他们的营养需求[6][7][8][9]。驴奶还是皮肤化妆品和各种美容产品的宝贵原料[10][11]。然而，由于驴的数量有限，而市场对驴产品的需求却在不断增加，这引发了严重关切。因此，在提高驴的繁殖效率的同时，确保优良品种的保存和延续已成为驴养殖业亟待解决的问题。
性腺发育是哺乳动物繁殖过程的核心。在小鼠中，交配后约6.5天（dpc）（相当于人类妊娠的第二周），原始生殖细胞（PGCs）的前体在近端后外胚层中形成[12]。7.5 dpc后，可以在胚外中胚层中识别出PGCs[13]。10.5 dpc至11.5 dpc期间，PGCs会在雄性和雌性胚胎的性腺嵴中定植，并保持“双重潜能”状态直到11.5 dpc[14]。性腺由体腔上皮细胞和间充质细胞组成，这些细胞在一系列遗传和激素因子的调控下增殖、迁移至生殖嵴，并最终分化为睾丸或卵巢[14]。
从胚胎阶段开始，基因、信号通路和细胞间相互作用之间的复杂相互作用共同调控着性腺的发育[15]。这种复杂的相互作用精确地调控着从出生后到性成熟的整个发育过程。近年来，驴的生殖生理学受到了越来越多的关注。研究主要集中在不同驴品种的卵巢卵泡动态和生殖激素谱型上[16][17][18][19][20]。驴的妊娠期相对较长，通常在348至377天之间，平均妊娠期为362±15.3天[21][22]。流产的平均妊娠期为316.13±36.6天[23]。相关研究表明，怀孕驴首次出现胚胎囊泡的时间为妊娠11.5±0.9天（即第10至13天）[24]。首次检测到囊泡后，它处于移动状态，直到妊娠15.5±1.4天（即第13至18天）时停止移动并进入固定阶段[24]。从形态和生长率的角度来看，囊泡的发育过程可分为三个阶段：第10至18天，囊泡保持球形并快速增长，平均每日生长3.2毫米[24]；第19至29天，囊泡形状变得不规则，生长速度显著下降，平均每日仅生长0.5毫米[24]；第29天后，囊泡的生长速度恢复到中等水平，平均每日生长1.6毫米，持续到第46天[24]。然而，以往对驴卵巢发育的研究仍然较少。将驴作为动物模型进行研究，有助于更深入地了解马类卵巢发育的机制。在胚胎移植过程中，可以通过预筛选高质量胚胎来提高成功率；在人工授精过程中，可以根据性别分化的原理优化授精方案，从而提高受孕率并促进马产业的高效发展。
在这里，我们利用单细胞测序技术构建了妊娠早期驴胚胎发育的单细胞图谱，以揭示性腺细胞的异质性和动态变化。这项研究对于全面理解马类性腺发育过程、生殖细胞的生成和成熟以及性别决定机制具有重要意义。
章节片段
动物和样本采集
本研究使用的组织样本来自妊娠4周的驴胚胎性腺和妊娠8周的胚胎（卵巢组织）。这些组织来自山东省东阿阿胶有限公司新鲜屠宰的驴。收集到的组织样本（共两份）各自被分成两等份：其中一份用于制备单细胞悬浮液，以获取驴卵巢的全面单细胞数据；
驴早期发育过程中卵巢组织形态及DDX4基因表达的鉴定
在本研究中，我们使用HE染色技术处理组织样本，并观察了两种组织的形态特征。实验结果清楚地表明，FG组织呈现相对较长且呈圆柱形的未分化状态，而EG组织则显示出卵巢特有的椭圆形结构（图1A-B）。随后，我们选择了特异性标记物DDX4来识别与卵巢发育密切相关的细胞
讨论
首先，HE染色结果显示FG组织呈现条带状形态，这与肾脏组织结构有一定相似性。先前的研究表明，在小鼠妊娠10 dpc时，生殖嵴表现为覆盖中肾腹侧的体腔上皮增厚[36][37]。同时，EG组织的HE染色结果显示出椭圆形的卵巢结构。这两个时期的卵巢发育状态具有明显差异
结论
总体而言，本研究利用单细胞RNA测序技术在单细胞水平上构建了妊娠早期驴胚胎性腺发育的全面转录组图谱。研究发现，驴的卵巢在EG阶段发育为卵巢结构，并明确了FG阶段和EG阶段在发育和功能特征上的差异。此外，还发现FG组织中的上皮细胞具有潜在的
作者贡献声明
Fangdi Zhang：方法学研究、实验设计。Hongli Song：数据分析、概念化。Ruixue Ma：数据可视化。Huajie Zhang：数据管理、概念化。Yujiang Sun：项目监督、资源协调、项目管理。Haiwei He：数据分析。Kaixuan Wang：实验设计。Yadan Jin：初稿撰写、可视化、结果验证。Guoliang Zhang：论文撰写、审稿编辑、项目管理、资金申请
利益冲突声明
我们声明所有作者均无任何利益冲突。本研究未涉及任何潜在的商业或财务利益关系。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（31902158）、山东省现代农业产业技术体系（SDAIT-08-16）、山东省自然科学基金（ZR2025MS511）、山东省关键技术研发计划（2021LZGC001）、青岛市自然科学基金（24-4-4-zrjj-144-jch）、山东省重大农业应用技术创新项目（SD2019 XM 008）以及高层次人才研究基金的支持
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。
