重组多表位疫苗对珍珠紫罗兰石斑鱼（♀Epinephelus fuscoguttatus × ♂Epinephelus lanceolatus）中传染性脾肾坏死病毒的免疫和保护作用
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多表位疫苗MEV通过免疫信息学筛选ISKNV CP蛋白的T/B细胞表位，显著提升鲈鱼对ISKNV的保护效果（存活率85.33%），并降低脾脏和肾脏病毒载量。研究验证了多表位疫苗在加速水产疫苗开发中的优势。
刘欣欣|孙云|何志凯|李波|宋文叶|刘宏丽|魏朝阳|吴英|曹振杰|张晨|周永灿
海南大学三亚育种繁殖研究院海洋生物与渔业学院，海洋科学技术协同创新中心，中国海南省海口市570228
摘要
传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的主要结构成分和关键抗原是衣壳蛋白（CP），但其抗原表位尚未得到充分研究。这些表位通常由约20个氨基酸残基组成，是决定抗原特异性的特定化学基团。为填补这一空白，我们利用免疫信息学方法分析了CP的表位。随后，设计、构建并筛选了一种针对ISKNV的多表位疫苗（MEV）。免疫反应评估显示，预测的三个T淋巴细胞表位和五个B淋巴细胞表位均具有抗原性、无毒性和非过敏性。将这些表位融合后制备出了MEV疫苗。在石斑鱼试验中，MEV疫苗显著上调了与免疫相关的基因（IL-1β、TNF-α、CD4、CD8α、MHC-Iα、MHC-IIα）的mRNA表达，并显著提高了总IgM水平，表明该疫苗能诱导细胞免疫和体液免疫。重要的是，与CP免疫相比，MEV疫苗对ISKNV的防护效果显著更强，存活率为85.33%。此外，MEV疫苗还显著降低了脾脏和肾脏中的病毒载量。本研究提出了一种经济、快速、安全且有效的水产疫苗开发策略，使MEV成为预防传染性脾肾坏死病的高度有前景的候选疫苗。
引言
传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是传染性脾肾坏死病（ISKND）的致病因子，对全球水产养殖构成了严重威胁。这种二十面体病毒（直径约150纳米）属于虹彩病毒科（Iridoviridae）的Megalocytivirus属（Mohr等人，2015年），其基因组为约110 kb的双链DNA，包含约124个开放阅读框（ORFs）。许多ORFs参与复制、病毒颗粒组装和宿主免疫逃逸等关键过程（Fu等人，2011年；Jian He，2000年）。ISKNV主要感染脾脏和肾脏组织，导致广泛的坏死。其快速传播、强烈的致病性和高死亡率在全球范围内造成了巨大的经济损失（Dong等人，2011年）。
ISKNV最初于2000年在中国淡水系统中的一种鲫鱼（Siniperca chuatsi）中被发现，此后已在全球范围内传播，宿主范围非常广泛，现已涵盖60多种海洋和淡水鱼类。虽然鲫鱼仍是主要宿主（Fu等人，2011年；Wang等人，2007年），但感染也已在多种鱼类中得到确认，包括石斑鱼（Epinephelus属）（Fusianto等人，2021年；Putra等人，2020年）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）（Ayiku等人，2024年）、亚洲海鲈（Lates calcarifer）（Kerddee等人，2021年）和大口黑鲈（Micropterus salmoides）（Xu等人，2023年）。感染的石斑鱼通常表现出明显的症状：完全拒食、皮肤变色、游泳异常、极度疲倦，死亡率常常达到60-100%（C. Chao，2004年；Huang等人，2020年）。尸检显示脾脏肿大和肾脏坏死，电子显微镜下可见大量的二十面体病毒颗粒（Fu等人，2015年）。虹彩病毒颗粒由三个部分组成：核心、衣壳和脂质膜。主要衣壳蛋白构成病毒衣壳的亚单位，占病毒颗粒的40-45%，在虹彩病毒科中高度保守（Fu等人，2012年；Zhao等人，2019年）。它是宿主抗体和免疫细胞识别的主要靶标，在自然感染过程中可引发强烈的免疫反应。因此，它常被用作ISKNV疫苗的首选抗原。目前报道的ISKNV疫苗主要包括亚单位疫苗、灭活疫苗和DNA疫苗（Du等人，2022年）。Fu等人使用pBV220原核表达载体生产重组MCP蛋白，并通过将MCP蛋白与ISA 763佐剂一起注射到鲫鱼体内，发现50 μg/鱼的剂量组保护率达到了64.3%（Fu等人，2012年）。Fu等人构建了一种pcMCP重组质粒DNA疫苗，并通过腹腔注射QCDC佐剂到鲫鱼体内，免疫28天后保护率达到80%（Fu等人，2014年）。Zhao等人使用功能化的碳纳米管作为载体，结合甘露糖修饰的MCP抗原蛋白，构建了一种靶向碳纳米管疫苗系统，免疫后的保护率达到81.3%（Zhao等人，2024年）。尽管MCP被认为是一个重要的候选抗原，但基于全长MCP的传统亚单位疫苗的保护效果有限。因此，迫切需要开发一种高效、安全且易于生产的新型ISKNV疫苗。然而，Zhang等人利用生物信息学技术分析了ISKNV的MCP和候选蛋白051 L，制备了一种融合截短蛋白亚单位疫苗，结果表明，这种截短蛋白tMCP与GEL02佐剂联合使用后，大口黑鲈的保护率达到85.01%（Zhang等人，2026年）。
珍珠龙鱼是一种具有商业价值的杂交品种（♀Epinephelus fuscoguttatus × ♂Epinephelus lanceolatus）（Fachry等人，2018年；Fusianto等人，2021年），因其生长迅速和肉质鲜嫩而受到青睐。自引入以来，它在东南亚地区广受欢迎，尤其是中国广东和海南等地的石斑鱼养殖中产量超过15万吨（Putra等人，2020年；Rimmer和Glamuzina，2019年）。然而，该物种因ISKNV感染而遭受了严重的经济损失（Huang等人，2020年；Subramaniam等人，2012年）。目前尚无针对ISKNV的特异性治疗方法。
疫苗作为主动免疫剂，对于预防病毒性疾病至关重要。传统方法需要培养病原体、灭活/减毒和纯化，通常资源消耗大且耗时（Saadi等人，2017年）。相比之下，多表位疫苗（MEVs）是一种创新且正在积极研究的策略（Raoufi等人，2020年；Zhang，2018年）。抗原表位通常由约20个氨基酸组成，是免疫系统特异性识别的关键抗原决定位点（Sadegh-Nasseri和Kim，2019年）。这些暴露在表面的氨基酸基团具有多样的结构和免疫反应性，通过其独特的三维构象决定抗原特异性。这些表位分为T细胞表位和B细胞表位，代表病原体的免疫活性区域（Bahrami等人，2019年）。B细胞表位通常位于表面，可直接被B细胞受体识别，可以是线性的或构象化的（Galanis等人，2021年；Kumar等人，2023年）。T细胞表位通常是线性肽（Schroeder等人，2023年），需要由抗原呈递细胞（APCs）处理并通过主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递给T细胞受体（TCRs），从而触发细胞免疫。
病毒表位具有保守的序列，是病毒抗原上与宿主免疫成分结合的特异性位点。除了基本的免疫作用外，它们在疫苗开发、诊断和治疗方面也具有巨大潜力。MEV设计通过合理组合来自单一或多个病原体的免疫优势表位与辅助抗原决定因子来增强特异性和稳定性，并扩大免疫覆盖范围（Mortazavi等人，2024年）。重要的是，MEV不含完整的病原体，消除了非免疫原性成分，避免了某些传统疫苗中存在的毒力恢复风险，从而提高了安全性（Jyotisha等人，2023年）。此外，表位修饰或多价组合可以优化免疫原性。MEV已证明对多种病原体具有特异性、安全性和高效力（Jyotisha等人，2023年；Ong等人，2020年；Tobuse等人，2022年；Zhou等人，2023年），具有低毒性、成本效益高、精准靶向和多表位结合的优势（Mortazavi等人，2024年）。
计算方法对于MEV的开发至关重要。分子对接模拟可以验证相互作用，特别是与模式识别受体（如Toll样受体TLRs）的相互作用，确保最佳的结合亲和力和免疫激活（Tunyasuvunakool等人，2021年）。因此，生物信息学工具对于表位预测和分子模型验证至关重要。整合多组学数据有助于阐明关键基因产物的特征——从生化参数到3D结构和免疫优势区域——从而简化抗原选择。先进的免疫信息学平台支持反向疫苗学研究，系统地筛选免疫反应性表位以获得强大的保护效果。因此，生物信息学在MEV的精确设计中得到了广泛应用，现已成为疫苗研发不可或缺的一部分。本研究旨在利用免疫信息学方法筛选ISKNV-CP蛋白中的有效B细胞和T细胞表位抗原。此外，我们在珍珠龙鱼模型中验证了多表位重组蛋白（MEV）的免疫原性和保护效果。这项研究为开发针对ISKNV的理性设计的多表位疫苗提供了关键基础和候选抗原。
CP蛋白的生物信息学分析
ISKNV的CP蛋白通过生物信息学技术进行了分析。图3A展示了CP蛋白表面的静电势能颜色结构图，红色区域表示负电区域，即电子富集区，蓝色区域表示正电区域。该势能图可视化了分子表面氢键供体（正电）和受体（负电）的位置，从而阐明了
讨论
ISKNV是一种新兴的跨界病原体，主要感染杂交石斑鱼（Epinephelus属），通过攻击脾脏和肾脏引发急性群体死亡（Throngnumchai等人，2021年）。该病毒可以在潜伏期后引发疫情，在症状出现后10天内导致超过90%的死亡率。疫苗接种是目前最有效的预防ISKNV的策略。现有的疫苗候选物包括灭活全细胞疫苗、重组亚单位疫苗和DNA疫苗，但存在一些局限性
结论
在本研究中，我们设计了一种针对ISKNV的多表位疫苗（MEV），包含三个T细胞表位和五个B细胞表位，这些表位均表现出高抗原性、非过敏性和非毒性。MEV已被证明能在石斑鱼中引发强烈的体液免疫和保护作用，表明免疫信息学是一种经济高效的水产疫苗开发策略。
CRediT作者贡献声明
张晨：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理。曹振杰：方法学，研究。吴英：监督，方法学，研究。魏朝阳：方法学，研究。何志凯：软件，方法学，研究。孙云：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理。刘欣欣：撰写 – 原稿，软件，方法学。周永灿：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。
未引用的参考文献
Chao和Y.L., 2004.
资助
海南省科学技术人员创新基金（KJRC2023B22），海南种子产业实验室（项目编号B24H10034），国家重点研发计划（2023YFD2402700），国家重点研发计划（2022YFD2401303），HNARS-石斑鱼专项基金（HNARS-03-G03），海南省高等教育机构科研项目（Hnky2025-9）。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
