《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Rapid and accurate detection of respiratory pathogens using a field-deployable POCT system based on multiplex real-time PCR
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本研究开发了一种基于现场快速检测（POCT）系统的多联实时PCR面板，可同步检测14种呼吸道病原体（如SARS-CoV-2、流感病毒、腺病毒等），检测时间30分钟，灵敏度达103拷贝/毫升，特异性、重复性和抗干扰能力优异，临床验证准确率97.09%，Kappa值0.94，为临床及时治疗和公共卫生决策提供高效可靠工具。
王海波|梁建国|陈凯|马远伟|张新迪|史永梅|李伟刚|魏岩|万能
中国广东省珠海市519020，珠海国际旅行医疗中心新兴传染病检测重点实验室
摘要
为了帮助临床医生更快、更准确地制定治疗方案，针对呼吸道感染患者，需要快速且准确的诊断方法。在本研究中，我们开发了一种基于便携式即时检测（POCT）系统的新设计的多重实时PCR检测面板，能够同时检测14种呼吸道病原体，包括SARS-CoV-2、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人类呼吸道合胞病毒、人类腺病毒、人类偏肺病毒、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、百日咳博德特氏菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌和肺炎衣原体。该检测方法可在30分钟内完成扩增，具有高特异性、重复性和抗干扰能力。对于大多数测试的呼吸道病原体，系统的检测下限为103拷贝/毫升。在临床评估中，该系统的阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、阳性一致率（PPA）、阴性一致率（NPA）和总准确率分别为100%、94.92%、93.62%和97.09%，Kappa值为0.94，表明该新系统具有很高的可靠性。总之，该系统为这些病原体的快速可靠诊断提供了一个有价值的平台，对临床医生和公共卫生政策制定者具有重要意义。
引言
呼吸道在复杂环境中不断暴露于各种病原体之中。当微生物突破鼻腔、咽喉、气管或支气管的防御屏障时，会引发从普通感冒到严重肺炎的各种感染，导致不同年龄段的发病率和死亡率显著增加[1,2]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，呼吸道感染及其并发症长期以来一直位列全球三大死亡原因之一[3]。大多数呼吸道病原体，包括细菌、病毒和等，会产生高度重叠的临床症状，通常表现为发热、咳嗽和/或头痛等非特异性症状[4]。由于不同病因可能表现出相似的症状，仅凭临床表现难以准确判断病因，从而影响正确的药物治疗或治疗方案。因此，病原体鉴定与治疗方法之间的密切关联突显了精准诊断在管理呼吸道感染中的核心价值。
传统的呼吸道病原体诊断方法，如血清学检测和细菌培养，要么耗时较长（细菌培养通常需要几天时间[5]），要么灵敏度较低且操作繁琐[6]。诊断延迟可能导致使用错误的药物治疗（例如，用抗生素治疗流感病毒感染），或者开具广谱抗生素，这可能会促进抗菌素耐药性的产生[7]，进而使治疗更加困难[8]。核酸扩增检测为呼吸道病原体提供了特异性和敏感性的检测手段。在我们之前的研究中，我们开发了几种用于检测呼吸道病原体的RT-PCR方法[9]。然而，这些方法可能不适合现场使用，因为现场往往缺乏分子生物学方面的专业知识。在野外环境中，等温扩增相比PCR更具实用性，尽管之前曾注意到特异性问题。因此，人们采用了结合免疫测定[10]、CRISPR/Cas系统[11]或纳米颗粒方法[12]等新技术。商业上，Luminex检测、TaqMan阵列卡或数字微流控RT-qPCR平台可以同时检测多种病毒和细菌[[13], [14], [15]]。BioFire FilmArray也能检测病毒、细菌和抗菌素耐药性标志物[16]。然而，这些检测方法需要特殊设计的耗材（如试剂盒），价格昂贵，可能不适合资源有限的发展中国家的常规诊断使用[17]。此外，它们的检测周期通常为一小时或更长时间，不适合快速诊断[18]。
在本研究中，我们开发了一种适用于现场使用的POCT系统，检测周期为30分钟，并进行了概念验证研究，使用新开发的多重qPCR面板同时检测14种呼吸道病原体。这14种常见的呼吸道病原体包括SARS-CoV-2、甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、人类呼吸道合胞病毒（RSV）、人类腺病毒（ADV）、人类偏肺病毒（hMPV）、肺炎链球菌（SP）、肺炎克雷伯菌（KP）、百日咳博德特氏菌（BP）、流感嗜血杆菌（Hi）、嗜肺军团菌（LP）、肺炎衣原体（MP）和肺炎衣原体（CP）。系统的分析灵敏度、分析特异性、重复性和抗干扰能力均得到了验证。商业qPCR检测方法被用作金标准，用于评估系统的临床性能，包括阳性预测值、阴性预测值、阳性一致率、阴性一致率和准确率。
部分内容
样本
含有目标基因区域的阳性质粒由Invitrogen有限公司（中国上海）合成，参考材料购自BDS生物技术公司（中国广州）。此外，还使用了2025年收集的103份口腔/咽喉拭子样本（包括单一感染和混合感染）进行检测。该研究获得了珠海国际旅行医疗中心伦理委员会的批准（编号20230913），并符合赫尔辛基宣言的要求。
系统的分析特异性、检测限（LOD）、重复性和抗干扰能力
系统的分析特异性是指能够仅检测目标病原体而不与其他目标发生交叉反应的能力。图2显示，只有这14种病原体能在各自的通道中产生扩增曲线。当使用其他病原体和健康捐赠者的样本作为目标时，无法获得扩增曲线。这些结果表明，该系统对这些14种病原体的检测具有高度特异性。
讨论
由于呼吸道感染及其并发症长期以来一直位列全球三大死亡原因之一，并引发了严重的公共卫生问题，因此需要快速且准确的诊断方法来帮助临床医生为呼吸道感染患者制定更快、更好的治疗方案。在本研究中，我们开发并评估了一种基于便携式即时检测（POCT）系统的新设计的多重实时PCR检测面板。
本研究开发的系统
资助
本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金（项目编号2023A1515220012）、国家重点研发计划（项目编号2024YFC2310205）和中国科学院科技计划（项目编号2024HK206）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析，也未参与决定发表该研究成果。
写作过程中未使用生成式AI或AI辅助技术
在准备本研究报告的过程中，未使用任何生成式AI或AI辅助技术。
作者贡献声明
概念构思：王海波；方法学：王海波、梁建国、陈凯、马远伟、张新迪、史永梅、李伟刚、魏岩、万能；资源获取：王海波、梁建国、李伟刚；初稿撰写：王海波；审稿与编辑：王海波、梁建国、陈凯、马远伟、张新迪、史永梅、李伟刚、魏岩、万能；可视化：王海波；监督：王海波、梁建国、李伟刚；项目管理：王海波；资金获取：王海波。
作者贡献声明
王海波：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、资源获取、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。梁建国：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、方法学。陈凯：撰写——审稿与编辑、方法学。马远伟：撰写——审稿与编辑、方法学。张新迪：撰写——审稿与编辑、方法学。史永梅：撰写——审稿与编辑、方法学。李伟刚：撰写——
