腺苷5’-三磷酸（ATP）是所有生物体的基本能量货币，对信号转导、细胞呼吸、酶催化、肌肉收缩以及各种关键生物功能至关重要[1]、[2]、[3]。ATP水平的波动与多种疾病相关，包括癌症、病毒感染和免疫功能障碍[4]、[5]。特别是，监测细菌ATP浓度是评估微生物污染和抗菌治疗效果、理解抗菌耐药性（AMR）的关键指标[6]、[7]。ATP是所有活细胞（包括细菌细胞）中的通用能量货币，在基本的代谢过程、复制和生存中起着重要作用。因此，ATP的存在和浓度是细胞代谢活动的公认生物标志物，进而可用于检测和量化活细菌[8]、[9]、[10]。开发用于细菌内直接ATP成像的荧光探针提供了一种互补且强大的方法，提供了空间信息并具有实时监测的潜力，正如先前的研究所示[11]、[12]、[13]、[14]。因此，实时ATP浓度的准确、灵敏和快速分析检测在多个领域都具有重要意义，包括环境监测、临床诊断，以及确保食品和饮料行业的安全与质量[13]、[15]、[16]。
目前，最成熟的ATP检测商业技术是生物发光测定法，该方法利用萤火虫荧光素酶。这种方法具有优异的灵敏度和简单的“混合测量”工作流程[17]。然而，它存在几个固有的局限性：所需的荧光素/荧光素酶试剂成本高昂且稳定性有限；酶促反应容易受到复杂样品（如饮料）中常见基质干扰物（如pH值、金属离子）的影响；并且无法进行空间成像或细胞内的实时监测[18]。相比之下，荧光探针因操作简便、高灵敏度和低检测限以及与生物成像的兼容性而受到广泛欢迎[13]、[14]、[19]。然而，大多数报道的ATP敏感荧光探针仍面临一个主要分析难题：缺乏对结构相似的生物多磷酸盐的全面选择性。要实现可靠的检测，探针必须克服双重选择性挑战：它必须区分ATP与（1）具有较少磷酸基团的腺嘌呤类似物（如ADP、AMP、cAMP），以及（2）具有相同三磷酸链但核碱基不同的核苷酸（如GTP、CTP、UTP）。虽然静电相互作用策略通常可以解决第一个挑战，但要同时解决第二个挑战则需要精确的多点识别腺嘌呤部分，这在小分子探针中很少实现。这种缺乏整体选择性的问题经常导致假阳性信号，严重限制了探针在复杂环境（如生物流体、活细胞和食品产品）中的可靠性。因此，迫切需要设计出具有这种双重区分能力的特异性结合结构的探针。这类先进的探针对于实时生物成像、即时诊断和现场食品安全监测的应用至关重要。虽然一些探针可以通过静电相互作用区分ATP与第一类物质（ADP/AMP）[20]、[21]、[22]、[23]，但要同时区分第二类物质（如GTP、CTP和UTP等核苷三磷酸盐）则需要通过特定的相互作用（如π-π堆叠和氢键）精确识别腺嘌呤部分[25]、[26]、[27]。目前，只有少数探针在两类干扰物中都表现出高选择性，这突显了改进分子设计的迫切需求[3]。
因此，开发一种能够区分这两类结构相似生物分子的荧光ATP探针仍然是一个重大挑战[23]、[28]、[29]、[30]。这一持续的局限性凸显了对新型高性能探针的迫切需求，这些探针能够在复杂的生物和食品基质中实现灵敏、快速和高度选择性的ATP定量[31]、[32]。与传统的荧光团不同，后者在聚集时会降低发射强度，而AIE基因在聚集或处于受限状态时仍表现出强烈的荧光[14]、[33]。这种独特的“开-关”切换机制由聚集时的分子内运动限制（RIM）控制，确保只有在特定目标结合时才会产生强烈的荧光信号，从而最小化了溶液中未结合探针的背景干扰，提高了信噪比，使其特别适用于浑浊或复杂的生物和环境介质中的传感应用[34]、[35]。
现有的主要基于TPE或TPA核心的ATP探针虽然对ADP和AMP具有优异的区分能力，但它们对结构相似的核苷三磷酸盐（CTP、UTP、GTP）的选择性仍不甚明了[20]、[28]、[29]、[30]、[36]、[37]（表S1）。此外，许多TPE衍生物的光不稳定性限制了其实际应用。这些挑战强调了需要结合严格选择性和提高稳定性的创新AIE骨架。特别是基于N-杂环的AIE基因，为结构多样性和可调电子性质提供了独特的机会，允许与分析物进行定制化的相互作用[38]、[39]。受新型化学骨架潜力的启发，我们团队最近开发了一种新的基于N-杂环的AIE核心：苯并[4,5]咪唑[1,2-c]嘧啶（BIP）（未发表的工作）。在这项研究中，我们报道了两种新型AIE活性荧光探针BIP-PP-1和BIP-PP-2的合理设计、简便合成和全面分析表征（方案1），它们均源自这种新的BIP核心。
在这里，我们报告了一种解决ATP传感双重选择性挑战的合理设计策略。基于我们的新型N-杂环AIE核心苯并[4,5]咪唑[1,2-c]嘧啶（BIP），我们设计了两种异构探针BIP-PP-1和BIP-PP-2。两者都具有相同的AIE活性BIP核心和两个用于静电锚定的吡啶基团，但吡啶环的取代模式不同。这种刻意设计的微妙结构变化旨在验证一个关键假设：两个阳离子中心之间的精确空间距离和取向对于最佳的多点识别ATP至关重要。我们推测这一几何因素将决定三磷酸配位的效率以及随后的共组装过程，从而决定选择性和灵敏度（方案1）。
我们的研究证实了这一设计原则。尽管两种探针都具有响应性，但BIP-PP-2作为优化后的结构表现出更优越的性能。它通过经典的基于AIE的“开启”机制作为高选择性和灵敏度的ATP分析探针：在水缓冲液中发射较弱，但在与阴离子ATP结合时通过静电、π-π堆叠和氢键相互作用的协同作用发生聚集，从而产生强烈的荧光增强。BIP-PP-2表现出优异的分析性能：它对ATP的响应迅速，线性范围广（0 – 90 μM），计算检测限（LOD）低至0.85 μM。重要的是，它对包括结构相似的磷酸盐ADP、cAMP、GTP、CTP、TTP、UTP和PPi在内的多种干扰生物物种表现出前所未有的选择性。与已报道的ATP活性探针相比，BIP-PP-2表现出竞争性或更优的性能。例如，尽管最近的基于TPE的探针具有约2-3 μM的优异线粒体靶向能力[20]、[23]，BIP-PP-2的LOD低至0.85 μM。与依赖硼酸基团进行核糖结合[21]或纯静电相互作用的探针不同[24]，BIP-PP-2的设计利用了静电锚定和与腺嘌呤碱基的特定π-π堆叠的协同作用，这对其区分GTP、TTP、CTP和UTP的能力至关重要。
为了展示其实际效用，我们成功使用BIP-PP-2直接定量细菌细胞中的ATP浓度。此外，我们利用该探针的高灵敏度和发光响应快速可视化检测饮料中的细菌污染。以含有E. coli的饮用水为模型，我们证明BIP-PP-2可以在便携式365纳米紫外灯下通过视觉观察有效检测低至3.9×105 CFU/mL的细菌污染。
这项工作验证了一种合理的ATP探针设计方法，并将BIP骨架引入作为功能性染料的新平台。它为快速生物分析和实时食品安全监测提供了新的分析平台。
